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裂解和蛋白提取的幾種方法介紹

2023-10-11 閱讀(464)

表面活性劑裂解方法:基于去污劑的裂解,去污劑裂解是一種較溫和的方法,適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、酵母和植物。將細(xì)胞懸液輕輕離心并重懸于含有去污劑的裂解緩沖液中,去污劑可用于破壞細(xì)胞膜。溶解細(xì)胞膜,裂解細(xì)胞并釋放其內(nèi)容物。如果去污劑干擾分析或生產(chǎn),則需要在下游處理中去除它們。
凍融裂解法:該方法適用于哺乳動(dòng)物或細(xì)菌細(xì)胞懸液。細(xì)胞懸液用液氮速凍。然后將樣品解凍并通過移液或在裂解緩沖液中輕輕渦旋重新懸浮,并重復(fù)此過程數(shù)次。在循環(huán)之間,將樣品離心并保留含有可溶性蛋白質(zhì)的上清液。
滲透休克法:這是一種非常溫和的方法,無需使用表面活性劑即可裂解懸浮的哺乳動(dòng)物或細(xì)菌細(xì)胞。這種方法通常與機(jī)械破碎技術(shù)相結(jié)合,依賴于從高滲透性介質(zhì)到低滲透性介質(zhì)的變化,非常適合隨后將裂解物分餾成亞細(xì)胞級(jí)分的應(yīng)用。
超聲處理:這種蛋白質(zhì)提取方法常用于細(xì)胞懸液。將探針插入樣品中,細(xì)胞會(huì)被高頻聲波破壞。聲波產(chǎn)生導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂的低壓區(qū)域。
機(jī)械破碎技術(shù):各種粗略但有效的“破碎和研磨"措施可用于從細(xì)胞和組織中提取蛋白質(zhì)。例如,液體剪切力可用于使用 Dounce 或 Potter-Elvehjem 均質(zhì)化方法破壞細(xì)胞膜。使用 Waring 攪拌器或 Polytron® 均質(zhì)器在冷卻的緩沖液中切碎或研磨組織來均質(zhì)化組織。在液氮中冷凍組織或細(xì)胞,加入氧化鋁或沙子,用研缽和研杵研磨成細(xì)粉??焖贁嚢杓?xì)胞和小玻璃珠會(huì)破壞細(xì)胞壁,對大多數(shù)革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌有效。
酶法:酶法通常用于從細(xì)菌、酵母或真核細(xì)胞中提取蛋白質(zhì),這些細(xì)胞被包裹在纖維組織中,細(xì)胞膜被強(qiáng)大的保護(hù)結(jié)構(gòu)包圍。溶菌酶(Lysozyme)、變?nèi)芫兀∕utanolysin)、MetaPolyzyme六種酶混合物、溶菌酶和鏈霉蛋白酶(Pronase)等細(xì)胞溶解酶或混合物可與組織消化酶(即膠原酶、軟骨素酶、透明質(zhì)酸酶)結(jié)合使用,用于溶解或破壞僅通過機(jī)械方法無法輕易裂解的結(jié)構(gòu),例如細(xì)胞壁、殼、膠囊、衣殼等。酶促裂解后,均質(zhì)化、超聲處理或劇烈渦旋通常在裂解緩沖液中進(jìn)行。
此外,由于細(xì)胞破碎會(huì)釋放內(nèi)源性蛋白酶和磷酸酶并降解靶蛋白,因此應(yīng)保護(hù)樣品在細(xì)胞破碎和隨后使用蛋白酶和磷酸酶抑制劑純化期間不會(huì)失控地丟失靶蛋白。




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