H7N9禽流感病毒核酸檢測試劑盒

廣州創(chuàng)侖生物制品有限公司

 
【檢驗原理】
本試劑盒基于實時熒光PCR技術(shù)，分別選取H7N9禽流感病毒的HA基因和NA基因保守區(qū)作為擴增靶區(qū)域，設(shè)計特異性引物探針，通過一步法實時熒光PCR體系擴增對H7N9禽流感病毒進(jìn)行定性檢測。反應(yīng)體系中除特異性引物和特異性熒光探針外，還配以對應(yīng)的PCR反應(yīng)Buffer、逆轉(zhuǎn)錄酶、Hot-Start Taq酶、核苷酸單體（dNTPs）、Mg2+等成分，可實現(xiàn)對H7N9禽流感病毒核酸靈敏特異地檢測。
【主要組成成分】

H7N9禽流感病毒核酸檢測試劑盒

【儲存條件及有效期】保存于-20±5℃，反復(fù)凍融次數(shù)＜5次，有效期9個月。

【適用儀器】ABI 7500、ABI 7300、LightCycler480等熒光定量PCR儀。

【樣本要求】
1 適用樣本類型：呼吸道樣本、血清、肺組織。
2 樣品采集、保存與運送。
標(biāo)本采集、保存、運送請遵循《人感染H7N9禽流感病毒標(biāo)本采集及實驗室檢測策略》。

【檢驗方法】
1.核酸提取
建議取200µl液態(tài)樣本進(jìn)行核酸提??；組織樣本可以研磨液進(jìn)行提取操作?？刹捎弥猩酱髮W(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的核酸提取試劑盒，請按照試劑盒說明書進(jìn)行操作；也可選擇其他合適的商業(yè)化產(chǎn)品。本試劑盒中的內(nèi)標(biāo)溶液參與提取過程，若提取試劑盒中未說明內(nèi)標(biāo)的使用方法可在每200µl樣本中加入4µl內(nèi)標(biāo)溶液后進(jìn)行核酸提取。
本試劑盒中的陰性質(zhì)控品參與提取，用于對環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控；AIV H7N9陽性質(zhì)控品不參與提取，用于PCR檢測試劑的質(zhì)控。
2.PCR擴增（ABI 7500儀器操作為例，ABI 7300、LC480等儀器參照此操作及儀器操作手冊）
2.1分別配制AIV H7 RT-PCR反應(yīng)體系和AIV N9 RT-PCR反應(yīng)體系
2.1.1 AIV H7 RT-PCR反應(yīng)體系配制
取適量PCR反應(yīng)管（按AIV H7反應(yīng)體系計算）；每管加入AIV H7 PCR反應(yīng)液A 17µl、AIV H7N9 PCR反應(yīng)液B 3µl（也可按照單個反應(yīng)的用量，計算PCR反應(yīng)液A、B各自所需總量，兩者混勻后分裝20µl于單個PCR反應(yīng)管中）。
2.1.2 AIV N9 RT-PCR反應(yīng)體系配制
取適量PCR反應(yīng)管（按AIV N9反應(yīng)體系計算）；每管加入AIV N9 PCR反應(yīng)液A 17µl、AIV H7N9 PCR反應(yīng)液B 3µl（也可按照單個反應(yīng)的用量，計算PCR反應(yīng)液A、B各自所需總量，兩者混勻后分裝20µl于單個PCR反應(yīng)管中）。
2.2 于上述PCR反應(yīng)管中分別加入處理后的陰性質(zhì)控品、AIV H7N9陽性質(zhì)控品、待測標(biāo)本核酸各5µl，8,000rpm離心數(shù)秒，放入PCR擴增儀。
2.3探針檢測模式設(shè)置為：Reporter Dye1：FAM，Quencher Dye：NONE，Reporter Dye2：Vic，Quencher Dye2：NONE， Passive Reference：NONE。反應(yīng)條件設(shè)置為：50℃ 15min，1個循環(huán)；95℃ 15分鐘，1個循環(huán)；94℃ 15秒→58℃ 45秒（收集熒光），45個循環(huán)。保存文件，運行。
3.結(jié)果分析
3.1 反應(yīng)結(jié)束后保存檢測數(shù)據(jù)文件。 
3.2 分析條件設(shè)置：根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值、stop值以及Threshold的Value值（用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整，Start值可以在3～15、End值可設(shè)在5～20，調(diào)整陰性對照的擴增曲線平直或低于閾值線），點擊Analysis自動獲得分析結(jié)果，在Report界面察看結(jié)果。

【質(zhì)量控制】
陰性質(zhì)控品：FAM檢測通路擴增曲線無對數(shù)增長期，VIC檢測通路擴增曲線為明顯對數(shù)增長期；
陽性質(zhì)控品：FAM檢測通路擴增曲線有明顯對數(shù)增長期，且FAM檢測通道擴增曲線 Ct值≤32；
以上要求需在同一次實驗中同時滿足，否則，本次實驗無效，需重新進(jìn)行。

【結(jié)果判定】
1.如果檢測樣品的AIV H7及N9 RT-PCR反應(yīng)體系FAM檢測通道均無擴增曲線或Ct值＞40，且在VIC檢測通道均有對數(shù)增長期，可判樣品為H7N9禽流感病毒陰性；
2.如果檢測樣品的AIV H7及N9 RT-PCR反應(yīng)體系擴增曲線在FAM,VIC檢測通道均有對數(shù)增長期且FAM檢測通道Ct值≤40；可判樣品為H7N9禽流感病毒陽性；
3.如果檢測樣品的AIV H7或N9 RT-PCR反應(yīng)體系僅其中之一的擴增曲線滿足判為陽性的要求，則需重復(fù)檢測；若重復(fù)檢測結(jié)果為H7及N9均陽性，則判H7N9禽流感病毒陽性；若重復(fù)檢測結(jié)果仍為H7（或N9）陽性，則只能判禽流感病毒H7（或N9）亞型陽性，并建議以其他方法做進(jìn)一步確認(rèn)。

【檢測方法的局限性】
1.樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送及保存質(zhì)量有關(guān)。
2.樣本處理時沒有控制好交叉污染，可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果。
3.病毒在流行過程中的基因突變則也可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。
4.由于不同提取方法的原理不同，采用不同核酸提取試劑進(jìn)行樣本處理時核酸提取效率存在一定差異，本試劑盒推薦使用本公司生產(chǎn)的核酸提取試劑盒（離心柱法），用戶可根據(jù)具體要求進(jìn)行選擇確認(rèn)。
5.本檢測結(jié)果僅供臨床參考，如需確診病例請結(jié)合臨床癥狀及其他檢測手段.

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】
根據(jù)產(chǎn)品分析性能評估結(jié)果，本試劑盒的分析靈敏度為1.0×103copies/ml。與感染部位相同或感染癥狀相似的其他病原體（甲型流感病毒H3亞型、甲型流感病毒H1亞型、乙型流感病毒、副流感病毒、禽流感H5亞型病毒、禽流感H9亞型病毒等）無交叉反應(yīng)。

【注意事項】
1.實驗室管理應(yīng)嚴(yán)格按照PCR基因擴增實驗室的管理規(guī)范，實驗人員必須進(jìn)行專業(yè)培訓(xùn)，實驗過程嚴(yán)格分區(qū)進(jìn)行（試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴增和產(chǎn)物分析區(qū)），所用消耗品應(yīng)滅菌后一次性使用，實驗操作的每個階段使用的儀器和設(shè)備，各區(qū)各階段用品不能交叉使用；
2.為試劑和標(biāo)本準(zhǔn)備階段提供生物安全柜，實驗過程中穿工作服，帶一次性手套，使用自卸管移液器；
3.試劑使用前要*解凍，8,000rpm離心數(shù)秒后使用；
4.標(biāo)本制備區(qū)所用過的吸頭請打入盛有消毒劑的容器，并與廢棄物一起滅菌后方可丟棄；
5.實驗完畢用10%次氯酸或75%酒精或紫外線燈處理工作臺和移液器；
6.本試劑盒內(nèi)陽性質(zhì)控品應(yīng)視為具有傳染性物質(zhì)，操作和處理均需符合相關(guān)法規(guī)要求：衛(wèi)生部《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通用準(zhǔn)則》和《醫(yī)療廢物管理條例》。