本視頻為普諾賽貼壁細(xì)胞傳代培養(yǎng)操作指南,對每一步操作都做了演示,以便實驗者更好地理解貼壁細(xì)胞傳代實驗過程。
貼壁細(xì)胞傳代實驗準(zhǔn)備:
將15mL離心管、T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶、PBS緩沖液、移液管、電動移液器等物品提前放入生物安全柜中,紫外照射30min消毒滅菌;
細(xì)胞*培養(yǎng)基、0.25%胰酶-0.02%EDTA從4℃冰箱中取出后,復(fù)溫至室溫,備用。
貼壁細(xì)胞傳代實驗步驟:
1. 將準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基等物品用酒精消毒后放入安全柜中;
2. 從培養(yǎng)箱中取出待處理的細(xì)胞,在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài);
3. 用酒精消毒培養(yǎng)瓶,放入安全柜中;
4. 輕輕吸去細(xì)胞上清;
5. 加入2~3ml PBS緩沖液潤洗一次,吸去上清;
6. 加入1mL 0.25%胰酶-0.02%EDTA,輕輕晃勻、覆蓋所有細(xì)胞后,置于37℃培養(yǎng)箱靜置消化;
7. 消化1min左右,在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況;
8. 消化*后,加3ml*培養(yǎng)基終止;
9. 按比例將細(xì)胞懸液分裝至培養(yǎng)瓶中;
10. 在顯微鏡下觀察傳代后的細(xì)胞密度及狀態(tài);
11. 將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
注意事項:
1)培養(yǎng)過程中需維持細(xì)胞處于對數(shù)生長期,80%左右即可傳代,傳代比例請參照說明書建議;
2)消化時間不宜過長,大部分細(xì)胞回縮變圓并有少量細(xì)胞脫落即可中止消化,難消化的細(xì)胞可分次消化,每次時間不超過5min;
3)培養(yǎng)過程中需要定期換液,一般細(xì)胞建議2~3天換液一次。