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本視頻為普諾賽貼壁細(xì)胞凍存操作指南，對每一步操作都做了演示，以便實(shí)驗(yàn)者更好地理解貼壁細(xì)胞凍存實(shí)驗(yàn)過程。

貼壁細(xì)胞凍存實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：
將15mL離心管、凍存管、PBS緩沖液、移液管、電動(dòng)移液器等物品提前放入生物安全柜中，紫外照射30min消毒滅菌；
細(xì)胞*培養(yǎng)基、0.25%胰酶-0.02%EDTA、細(xì)胞凍存液等從4℃冰箱中取出后，復(fù)溫至室溫，備用；程序降溫盒復(fù)溫至室溫備用。

貼壁細(xì)胞凍存操作步驟：
1. 從培養(yǎng)箱中取出準(zhǔn)備凍存的細(xì)胞；
2. 顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)并拍照記錄；
3. 酒精消毒培養(yǎng)瓶后放入安全柜中；
4. 吸去多余的培養(yǎng)基，加人2~3ml PBS緩沖液潤洗一次；
5. 加入1ml胰酶，放入37℃消化；
6. 消化1min左右，在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況；  
7. 消化*后，加3ml*培養(yǎng)基終止；
8. 將細(xì)胞懸液移入15ml離心管中離心，1000rpm/min（約200g）離心3-5min；
9. 吸去多余的液體，向細(xì)胞沉淀中加入適量的凍存液，輕輕吸打混勻；
10. 按比例分裝至凍存管中；
11. 貼好標(biāo)簽后放入梯度凍存盒中；
12. 將凍存盒放入-80℃，降溫過夜后，移入液氮中保存。

注意事項(xiàng)：
1）細(xì)胞凍存液需提前配制，不可直接將DMSO加入細(xì)胞懸液中；
2）不同細(xì)胞消化時(shí)間有差異，以實(shí)際鏡檢結(jié)果為準(zhǔn)，大部分細(xì)胞回縮變圓并有少量細(xì)胞脫落即可中止消化，消化時(shí)間不宜過長；
3）應(yīng)選擇匯合度80%-90%左右，細(xì)胞處于對數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行凍存操作，確保細(xì)胞凍存時(shí)狀態(tài)最佳，凍存密度可根據(jù)細(xì)胞特性進(jìn)行調(diào)整；
4）凍存細(xì)胞保存溫度應(yīng)低于-130℃，不可在-80℃長期保存。