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貼壁細(xì)胞的凍存
發(fā)布時(shí)間:2022-03-11 播放次數(shù)229次
視頻簡介

本視頻為普諾賽貼壁細(xì)胞凍存操作指南,對(duì)每一步操作都做了演示,以便實(shí)驗(yàn)者更好地理解貼壁細(xì)胞凍存實(shí)驗(yàn)過程。

貼壁細(xì)胞凍存實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備:
15mL離心管、凍存管、PBS緩沖液、移液管、電動(dòng)移液器等物品提前放入生物安全柜中,紫外照射30min消毒滅菌;
細(xì)胞*培養(yǎng)基、0.25%胰酶-0.02%EDTA、細(xì)胞凍存液等從4℃冰箱中取出后,復(fù)溫至室溫,備用;程序降溫盒復(fù)溫至室溫備用。


貼壁細(xì)胞凍存操作步驟:
1. 從培養(yǎng)箱中取出準(zhǔn)備凍存的細(xì)胞;
2. 顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)并拍照記錄;
3. 酒精消毒培養(yǎng)瓶后放入安全柜中;
4. 吸去多余的培養(yǎng)基,加人2~3ml PBS緩沖液潤洗一次;
5. 加入1ml胰酶,放入37℃消化;
6. 消化1min左右,在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況;  
7. 消化*后,加3ml*培養(yǎng)基終止;
8. 將細(xì)胞懸液移入15ml離心管中離心,1000rpm/min(約200g)離心3-5min;
9. 吸去多余的液體,向細(xì)胞沉淀中加入適量的凍存液,輕輕吸打混勻;
10. 按比例分裝至凍存管中;
11. 貼好標(biāo)簽后放入梯度凍存盒中;
12. 將凍存盒放入-80℃,降溫過夜后,移入液氮中保存。


注意事項(xiàng):
1)細(xì)胞凍存液需提前配制,不可直接將DMSO加入細(xì)胞懸液中;
2)不同細(xì)胞消化時(shí)間有差異,以實(shí)際鏡檢結(jié)果為準(zhǔn),大部分細(xì)胞回縮變圓并有少量細(xì)胞脫落即可中止消化,消化時(shí)間不宜過長;
3)應(yīng)選擇匯合度80%-90%左右,細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行凍存操作,確保細(xì)胞凍存時(shí)狀態(tài)最佳,凍存密度可根據(jù)細(xì)胞特性進(jìn)行調(diào)整;
4)凍存細(xì)胞保存溫度應(yīng)低于-130℃,不可在-80℃長期保存。

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