目錄:北京蘭博利德商貿(mào)有限公司>>分子生物學(xué)試劑>>qPCR相關(guān)>> R02022x Realab Green PCR Fast mixture通用型
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 100T,500T,1000T |
|---|---|---|---|
| 貨號 | R0202 |
Taq SYBR® Green qPCR Premix (通用型)
產(chǎn)品貨號：R0202
儲存條件：長期保存請于 -20℃避光保存，Mix 融解后可在 4℃避光條件下穩(wěn)定存放一個月，盡量避免反復(fù)凍融。
2x Realab Green PCR Fast mixture通用型產(chǎn)品簡介
Taq SYBR® Green qPCR Premix 是 SYBR® Green I 嵌合染料法專用qPCR試劑，為2×預(yù)混液，包含除引物和DNA樣品以外的所有qPCR組分，可減少操作步驟，縮短加樣時間，降低污染幾率。其核心組分是經(jīng)抗體修飾的熱啟動Taq DNA聚合酶，配合精心優(yōu)化的Buffer體系以及PCR反應(yīng)促進(jìn)因子，使產(chǎn)品具有特異性強(qiáng)、擴(kuò)增效率高等特點，有效抑制非特異性擴(kuò)增，可對寬廣濃度范圍的模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量，獲得穩(wěn)定可靠的qPCR結(jié)果。
2x Realab Green PCR Fast mixture通用型使用方法：
1.適配機(jī)型
全機(jī)型通用
2.使用注意
① 因Mix中預(yù)混有染料，其保存或反應(yīng)體系配制過程應(yīng)避免強(qiáng)光照射；
② 使用前上下顛倒輕輕混勻Mix，請勿渦旋振蕩混勻，避免產(chǎn)生過多氣泡。
3.建議的qPCR反應(yīng)體系
| 試劑 | 使用量 | 終濃度 |
| Taq SYBR® Green qPCR Premix | 10ul | 1× |
| 正向引物 (10uM)a | 0.4ul | 0.2uM |
| 反向引物(10uM)a | 0.4ul | 0.2uM |
| DNA模板b | X ul | 10~200 ng/20ul |
| Nuclease-Free Water | To 20ul |
a.調(diào)通推薦的引物終濃度為0.2uM，反應(yīng)效果不佳時可在0.1~1uM范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)整;
b.推過薦模板加樣量的為1~2ul，如模板類型為未稀釋cDNA原液，模板添加量不應(yīng)超過總反應(yīng)體系的10%，不同種類DNA模板中含有的靶基因拷貝數(shù)目不同，必要時可進(jìn)行梯度稀釋，以確定必要的DNA模板添加量。
4.qPCR 反應(yīng)程序（可根據(jù)機(jī)型適當(dāng)調(diào)整）
兩步法：
三步法：
a.根據(jù)引物的Tm值進(jìn)行退火&延伸（退火）溫度的設(shè)定；若擴(kuò)增片段在200bp以內(nèi)，退火&延伸（延伸）時間可以設(shè)置為15sec;此外，退火&延伸（延伸）時間的設(shè)置還需根據(jù)您使用的qPCR儀所需的最短數(shù)據(jù)采集時間自行調(diào)整；
b.不同 qPCR 儀的熔解曲線采集程序有差別，一般可使用儀器默認(rèn)的熔解曲線采集程序。
5.實驗優(yōu)化
若使用默認(rèn)反應(yīng)條件反應(yīng)性能不佳時，則需要進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化，可以從引物濃度以及擴(kuò)增程序兩個方面進(jìn)行：
① 引物濃度調(diào)整
當(dāng)引物終濃度在0.1~1.0uM范圍之間變化時，引物濃度越低，擴(kuò)增特異性越高，但擴(kuò)增效率會有所下降。
② 擴(kuò)增程序優(yōu)化
需提高擴(kuò)增特異性，可使用兩步法程序或提高退火溫度；需提高擴(kuò)增效率，可使用三步法程序或延長延伸時間。
6.引物設(shè)計原則
① 擴(kuò)增產(chǎn)物長度建議控制在80~200bp；
② 引物長度為18~25bp；
③ 正向引物和反向引物的Tm值相差不超過 1℃為佳，Tm值控制在58~62℃為佳；
④ 引物的GC含量控制在 40%~60% 之間；
⑤ 引物A、G、C、T整體分布盡量要均勻，避開T/C或者A/G的連續(xù)結(jié)構(gòu)（特別是3'端）；
⑥ 引物3'端zuihou一個堿基zuihao為G或者C；
⑦ 避開引物內(nèi)部或者兩條引物之間的互補(bǔ)序列；
⑧ 使用NCBI BLAST功能檢索確認(rèn)引物的特異性。
| 問題描述 | 可能原因 | 解決辦法 |
| 擴(kuò)增曲線不光滑 | 熒光信號太弱，經(jīng)系統(tǒng)校正后產(chǎn)生 | 確保Mix中預(yù)混的染料未降解；更換熒光信號收集更好的qPCR專用耗材 |
| 擴(kuò)增曲線斷裂或下滑 | 模板濃度較高，基線的終點值大于Cq 值 | 減小基線終點(Cq-4)，重新分析數(shù)據(jù) |
| 個別孔擴(kuò)增曲線突然驟降 | 反應(yīng)管內(nèi)留有氣泡 | 確保Mix*溶解，請勿渦旋振蕩混勻 加樣完成后輕彈離心去除氣泡 延長預(yù)變性時間至10min，以去除氣泡 |
|
反應(yīng)結(jié)束無擴(kuò)增曲線出現(xiàn) | 反應(yīng)循環(huán)數(shù)偏少 | 設(shè)置循環(huán)數(shù)為40，但更多的循環(huán)數(shù)會增加過多的背景信號 |
| 熒光信號采集步驟未設(shè)置或者設(shè)置錯誤 | 兩步法擴(kuò)增程序一般將信號采集設(shè)置在退火&延伸階段，三步法擴(kuò)增程序應(yīng)當(dāng)將信號采集設(shè)置在72℃延伸階段 | |
| 引物可能降解 | 長期未用的引物，應(yīng)先通過PAGE電泳檢測完整性，以排除其降解的可能 | |
| 模板濃度過低 | 減少模板稀釋倍數(shù)重復(fù)實驗，樣品濃度未知的情況下先從higest濃度做起 | |
| 模板降解 | 重新制備模板，重復(fù)實驗 | |
|
Cq 值出現(xiàn)過晚 | 擴(kuò)增效率低 | 提高引物濃度，嘗試三步法擴(kuò)增程序，或者重新設(shè)計引物 |
| 模板濃度過低 | 減少模板稀釋倍數(shù)重復(fù)實驗，樣品濃度未知的情況下先從GAO濃度做起 | |
| 模板降解 | 重新制備模板，重復(fù)實驗 | |
| 擴(kuò)增產(chǎn)物過長 | 擴(kuò)增產(chǎn)物長度控制在80~200 bp | |
| 體系中存在 PCR 抑制劑 | 一般為模板帶入，加大模板稀釋倍數(shù)或重新制備純度高的模板重復(fù)實驗 | |
|
空白對照出現(xiàn)信號 | 反應(yīng)體系污染 | 首先更換空白對照的水，如果還發(fā)生同樣情況，繼續(xù)更換引物、吸頭、PCR 管或啟用新的Mix；反應(yīng)體系在超凈工作臺內(nèi)配制，減少氣溶膠污染 |
| 出現(xiàn)引物二聚體等非特異性擴(kuò)增 | 一分般析在 35 循環(huán)以后空白對照出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物屬正常情況，應(yīng)配合熔解曲線進(jìn)行重新設(shè)計引物，調(diào)整引物濃度或優(yōu)化PCR反應(yīng)程序 | |
|
熔解曲線出現(xiàn)多峰 | 引物設(shè)計不佳 | 根據(jù)引物設(shè)計原則重新設(shè)計新引物 |
| 引物濃度過高 | 適當(dāng)降低引物濃度 | |
| cDNA 模板存在基因組污染 | 提取后的RNA溶液使用DNA酶進(jìn)行消化，例如：dsDNase，以去除基因組污染，或設(shè)計跨內(nèi)含子引物 | |
|
實驗重復(fù)性差 | 加樣誤差大 | 使用精準(zhǔn)的移液器、配合高品質(zhì)吸頭準(zhǔn)確移液 高倍稀釋模板，加入大體積模板減少加樣誤差 放大qPCR反應(yīng)體積 |
| 模板濃度過低 | 減少模板稀釋倍數(shù)重復(fù)實驗 | |
| qPCR儀不同位置的溫度偏差 | 定期校準(zhǔn)qPCR儀 |
(空格分隔,最多3個,單個標(biāo)簽最多10個字符)
4
化工儀器網(wǎng)