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目錄:北京蘭博利德商貿(mào)有限公司>>分子生物學(xué)試劑>>qPCR相關(guān)>> R02022x Realab Green PCR Fast mixture通用型

2x Realab Green PCR Fast mixture通用型
  • 2x Realab Green PCR Fast mixture通用型
參考價170-2800
具體成交價以合同協(xié)議為準(zhǔn)

參考價:¥170 ~ ¥2800

具體成交價以合同協(xié)議為準(zhǔn)
  • 品牌
  • R0202 型號
  • 代理商 廠商性質(zhì)
  • 北京市 所在地
規(guī)格

100T 500T 1000T >

屬性

供貨周期:現(xiàn)貨 規(guī)格:100T,500T,1000T 貨號:R0202

>
規(guī)格
100T170元9999 件 可售
500T750元9999 件 可售
1000T1350元9999 件 可售

更新時間:2024-12-12 11:26:42瀏覽次數(shù):671評價

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供貨周期 現(xiàn)貨 規(guī)格 100T,500T,1000T
貨號 R0202
2x Realab Green PCR Fast mixture通用型,為2×預(yù)混液,包含除引物和DNA樣品以外的所有qPCR組分,可減少操作步驟,縮短加樣時間,降低污染幾率。

Taq SYBR® Green qPCR Premix (通用型)

產(chǎn)品貨號:R0202

儲存條件:長期保存請于 -20℃避光保存,Mix 融解后可在 4℃避光條件下穩(wěn)定存放一個月,盡量避免反復(fù)凍融。

2x Realab Green PCR Fast mixture通用型產(chǎn)品簡介

Taq SYBR® Green qPCR Premix 是 SYBR® Green I 嵌合染料法專用qPCR試劑,為2×預(yù)混液,包含除引物和DNA樣品以外的所有qPCR組分,可減少操作步驟,縮短加樣時間,降低污染幾率。其核心組分是經(jīng)抗體修飾的熱啟動Taq DNA聚合酶,配合精心優(yōu)化的Buffer體系以及PCR反應(yīng)促進(jìn)因子,使產(chǎn)品具有特異性強(qiáng)、擴(kuò)增效率高等特點,有效抑制非特異性擴(kuò)增,可對寬廣濃度范圍的模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量,獲得穩(wěn)定可靠的qPCR結(jié)果。

2x Realab Green PCR Fast mixture通用型使用方法:

1.適配機(jī)型

全機(jī)型通用

2.使用注意

① 因Mix中預(yù)混有染料,其保存或反應(yīng)體系配制過程應(yīng)避免強(qiáng)光照射;

② 使用前上下顛倒輕輕混勻Mix,請勿渦旋振蕩混勻,避免產(chǎn)生過多氣泡。

3.建議的qPCR反應(yīng)體系

試劑

使用量

終濃度

Taq SYBR® Green qPCR Premix

10ul

正向引物 (10uM)a

0.4ul

0.2uM

反向引物(10uM)a

0.4ul

0.2uM

DNA模板b

X ul

10~200 ng/20ul

Nuclease-Free Water

To 20ul


a.調(diào)通推薦的引物終濃度為0.2uM,反應(yīng)效果不佳時可在0.1~1uM范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)整;

b.推過薦模板加樣量的為1~2ul,如模板類型為未稀釋cDNA原液,模板添加量不應(yīng)超過總反應(yīng)體系的10%,不同種類DNA模板中含有的靶基因拷貝數(shù)目不同,必要時可進(jìn)行梯度稀釋,以確定必要的DNA模板添加量。

4.qPCR 反應(yīng)程序(可根據(jù)機(jī)型適當(dāng)調(diào)整)

兩步法:

2x Realab Green PCR Fast mixture通用型

三步法:

2x Realab Green PCR Fast mixture通用型

a.根據(jù)引物的Tm值進(jìn)行退火&延伸(退火)溫度的設(shè)定;若擴(kuò)增片段在200bp以內(nèi),退火&延伸(延伸)時間可以設(shè)置為15sec;此外,退火&延伸(延伸)時間的設(shè)置還需根據(jù)您使用的qPCR儀所需的最短數(shù)據(jù)采集時間自行調(diào)整;

b.不同 qPCR 儀的熔解曲線采集程序有差別,一般可使用儀器默認(rèn)的熔解曲線采集程序。

5.實驗優(yōu)化

若使用默認(rèn)反應(yīng)條件反應(yīng)性能不佳時,則需要進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化,可以從引物濃度以及擴(kuò)增程序兩個方面進(jìn)行:

① 引物濃度調(diào)整

當(dāng)引物終濃度在0.1~1.0uM范圍之間變化時,引物濃度越低,擴(kuò)增特異性越高,但擴(kuò)增效率會有所下降。

② 擴(kuò)增程序優(yōu)化

需提高擴(kuò)增特異性,可使用兩步法程序或提高退火溫度;需提高擴(kuò)增效率,可使用三步法程序或延長延伸時間。

6.引物設(shè)計原則

① 擴(kuò)增產(chǎn)物長度建議控制在80~200bp;

② 引物長度為18~25bp;

③ 正向引物和反向引物的Tm值相差不超過 1℃為佳,Tm值控制在58~62℃為佳;

④ 引物的GC含量控制在 40%~60% 之間;

⑤ 引物A、G、C、T整體分布盡量要均勻,避開T/C或者A/G的連續(xù)結(jié)構(gòu)(特別是3'端);

⑥ 引物3'端zuihou一個堿基zuihao為G或者C;

⑦ 避開引物內(nèi)部或者兩條引物之間的互補(bǔ)序列;

⑧ 使用NCBI BLAST功能檢索確認(rèn)引物的特異性。


問題描述

可能原因

解決辦法

擴(kuò)增曲線不光滑

熒光信號太弱,經(jīng)系統(tǒng)校正后產(chǎn)生

確保Mix中預(yù)混的染料未降解;更換熒光信號收集更好的qPCR專用耗材

擴(kuò)增曲線斷裂或下滑

模板濃度較高,基線的終點值大于Cq 值

減小基線終點(Cq-4),重新分析數(shù)據(jù)

個別孔擴(kuò)增曲線突然驟降

反應(yīng)管內(nèi)留有氣泡

確保Mix*溶解,請勿渦旋振蕩混勻

加樣完成后輕彈離心去除氣泡

延長預(yù)變性時間至10min,以去除氣泡


反應(yīng)結(jié)束無擴(kuò)增曲線出現(xiàn)

反應(yīng)循環(huán)數(shù)偏少

設(shè)置循環(huán)數(shù)為40,但更多的循環(huán)數(shù)會增加過多的背景信號

熒光信號采集步驟未設(shè)置或者設(shè)置錯誤

兩步法擴(kuò)增程序一般將信號采集設(shè)置在退火&延伸階段,三步法擴(kuò)增程序應(yīng)當(dāng)將信號采集設(shè)置在72℃延伸階段

引物可能降解

長期未用的引物,應(yīng)先通過PAGE電泳檢測完整性,以排除其降解的可能

模板濃度過低

減少模板稀釋倍數(shù)重復(fù)實驗,樣品濃度未知的情況下先從higest濃度做起

模板降解

重新制備模板,重復(fù)實驗


Cq 值出現(xiàn)過晚

擴(kuò)增效率低

提高引物濃度,嘗試三步法擴(kuò)增程序,或者重新設(shè)計引物

模板濃度過低

減少模板稀釋倍數(shù)重復(fù)實驗,樣品濃度未知的情況下先從GAO濃度做起

模板降解

重新制備模板,重復(fù)實驗

擴(kuò)增產(chǎn)物過長

擴(kuò)增產(chǎn)物長度控制在80~200 bp

體系中存在 PCR 抑制劑

一般為模板帶入,加大模板稀釋倍數(shù)或重新制備純度高的模板重復(fù)實驗


空白對照出現(xiàn)信號

反應(yīng)體系污染

首先更換空白對照的水,如果還發(fā)生同樣情況,繼續(xù)更換引物、吸頭、PCR

管或啟用新的Mix;反應(yīng)體系在超凈工作臺內(nèi)配制,減少氣溶膠污染

出現(xiàn)引物二聚體等非特異性擴(kuò)增

一分般析在 35 循環(huán)以后空白對照出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物屬正常情況,應(yīng)配合熔解曲線進(jìn)行重新設(shè)計引物,調(diào)整引物濃度或優(yōu)化PCR反應(yīng)程序


熔解曲線出現(xiàn)多峰

引物設(shè)計不佳

根據(jù)引物設(shè)計原則重新設(shè)計新引物

引物濃度過高

適當(dāng)降低引物濃度

cDNA 模板存在基因組污染

提取后的RNA溶液使用DNA酶進(jìn)行消化,例如:dsDNase,以去除基因組污染,或設(shè)計跨內(nèi)含子引物


實驗重復(fù)性差

加樣誤差大

使用精準(zhǔn)的移液器、配合高品質(zhì)吸頭準(zhǔn)確移液

高倍稀釋模板,加入大體積模板減少加樣誤差

放大qPCR反應(yīng)體積

模板濃度過低

減少模板稀釋倍數(shù)重復(fù)實驗

qPCR儀不同位置的溫度偏差

定期校準(zhǔn)qPCR儀






 

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