人腫瘤壞死因子 (TNF-α) ELISA 檢測試劑盒說明書

貨號：HG-TA001

產(chǎn)品簡介：

本試劑盒采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測(ELISA)法，將人TNF-a標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣本加入預(yù)包被抗人 TNF-a抗體的酶標(biāo)板，然后加入稀釋后的生物i素標(biāo)記的人 TNF-a檢測抗體，最后加入 Streptavidin-HRP，形成抗體+抗原+抗體-Biotin+ SA-HRP 復(fù)合物，洗板后加入 TMB 顯色液顯色。TMB 在 HRP酶的催化下由無色轉(zhuǎn)化成藍(lán)色并在終止液的作用下最終轉(zhuǎn)化成黃色。黃色的深淺與樣本中被檢測到的人 TNF-α 的量呈正相關(guān)。

檢測范圍: 1.37~1000pg/mL

靈敏度:0.21 pg/mL

規(guī)格：

96T

應(yīng)用：

適用于生物制品純化工藝過程的優(yōu)化、中間工藝過程的雜質(zhì)控制以及終產(chǎn)品的放行檢測。

試劑盒組成：

備 注:所有組分存儲溫度均為 2~8℃，有效期12個月。

需自行準(zhǔn)備的材料

◆酶標(biāo)儀

◆去離子水

◆恒溫培養(yǎng)箱

◆全新濾紙

◆微量移液器及吸頭

◆渦旋振蕩器

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1.所有試劑以及待測樣本需要恢復(fù)室溫(18~25°C)。所有試劑現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.1x 洗液配制：濃縮洗液平衡至室溫（18-25℃），不要有結(jié)晶?；靹蚝蟾鶕?jù)用量，取適量用超純水按1：9的比例，將10x洗液稀釋10倍，最終得到1x洗液。

3.標(biāo)準(zhǔn)品的配制:

S1至 S7 和 S0 用于血清和血漿。

其他類型樣本，用緩沖液(SPB,樣品基質(zhì))制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，例如細(xì)胞培養(yǎng)上清液、組織研磨液、細(xì)胞裂解物等。尿樣使用AB(檢測緩沖液)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。

人TNFa標(biāo)準(zhǔn)品S(10000pg/mL)30μL+270μLSPB作為高標(biāo)準(zhǔn)(1000 pg/mL)，每個稀釋試管中加入 200 μLSPB,使用高標(biāo)準(zhǔn)品按 1:2 梯度稀釋。每一步稀釋必須充分混勻。SPB用作零標(biāo)準(zhǔn)(0pg/mL)。

操作步驟

使用前所有試劑組分以及待測樣本需要恢復(fù)室溫(18~25°C)。建議所有的標(biāo)準(zhǔn)品和待檢樣本進(jìn)行雙復(fù)孔測定。

1.試劑準(zhǔn)備:提前準(zhǔn)備好各種待測試劑、稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣本。

2.酶標(biāo)板條確定：計(jì)算待測樣本和標(biāo)準(zhǔn)品所需酶標(biāo)板條，將酶標(biāo)條從鋁箔袋取出，剩余的酶標(biāo)條放回鋁箔袋中并封好袋口，低溫保存。

3.每孔加入 50uL 檢測緩沖液。

4.樣本及檢測抗體孵育：每孔加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣本，確保15 min內(nèi)完成點(diǎn)樣。再向每孔加入50 μL 檢測抗體。用封板膜封板，置于恒溫孵育器，500轉(zhuǎn)/分鐘、25℃孵育1小時。

5.洗板：棄去孔中液體，加入1×洗液（300 μL/孔）洗板4次，拍干酶標(biāo)板中殘留液體。

6.酶結(jié)合物孵育：將酶結(jié)合物加入酶標(biāo)板中，100 μL/孔，用封板膜封板，置于恒溫孵育器，500轉(zhuǎn)/分鐘、25℃孵育30分鐘。

7.洗板:同步驟 5。

8.每孔加入100 μL顯色底物TMB，室溫（18-25℃）孵育15~20分鐘。

9.終止:每孔加入 100 uL終止液，輕輕震動酶標(biāo)板至顯色均勻。

10.讀值:20 min 內(nèi)讀取 450nm/630nm 波長處的吸光度值。450nm 作為檢測波長，630nm 作為參比波長。

結(jié)果處理

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線OD處理（見下例，僅為示例，具體以實(shí)際測定為準(zhǔn)）

2. 標(biāo)準(zhǔn)品理論濃度與對應(yīng) OD 值以四參數(shù)進(jìn)行擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(如下圖所示)。

注意事項(xiàng)

1.樣品首i次檢測，建議進(jìn)行至少3個連續(xù)倍數(shù)的稀釋，以在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)產(chǎn)生至少一個稀釋后樣品。

2.試劑按標(biāo)簽說明儲存，使用前室溫(18-25°C)平衡。

3.包被酶標(biāo)板使用前，請平衡至室溫(18-25°C)再打開外包裝袋，實(shí)驗(yàn)中不用的板條立即放回包裝中密封，4℃可保存一個月其余不用試劑應(yīng)包裝好或蓋好。

4.實(shí)驗(yàn)操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。

5.使用前檢查試劑盒內(nèi)各種試劑。試劑稀釋、加樣和終止反應(yīng)應(yīng)充分混勻或搖勻?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果尤為重要。

6.洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在潔凈的紙中上充分拍干，直至看不到水印。勿將紙巾直接放入反應(yīng)孔中吸水。

7.底物顯色液對光敏感，避免長時間暴露于光下，避免與金屬接觸影響結(jié)果。

8.本產(chǎn)品為一次性使用的試劑盒，請?jiān)谛趦?nèi)使用。

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