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當(dāng)前位置:北京諾博萊德科技有限公司>>生化試劑>>輔酶Ⅱ系列>> BF6001輔酶ⅡNADP(H)含量試劑盒 輔酶Ⅱ

輔酶ⅡNADP(H)含量試劑盒 輔酶Ⅱ

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具體成交價以合同協(xié)議為準(zhǔn)

產(chǎn)品型號BF6001

品       牌NobleRyder/諾博萊德

廠商性質(zhì)生產(chǎn)商

所  在  地北京市

更新時間:2025-03-31 14:38:10瀏覽次數(shù):35次

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供貨周期 現(xiàn)貨 規(guī)格 50T/24S
貨號 BF6001 應(yīng)用領(lǐng)域 環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁,制藥/生物制藥
主要用途 NADPH/NADP+比值不僅是細(xì)胞氧化還原態(tài)的主要標(biāo)志之一
輔酶ⅡNADP(H)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,NADP+和 NADPH 含量測定可以計算NADP(NADPH + NADP+ )含量和 NADPH/NADP+比值,其變化與磷酸戊糖途徑和生物合成以及抗氧化反應(yīng)密切相關(guān)。NADPH/NADP+比值不僅是細(xì)胞氧化還原態(tài)的主要標(biāo)志之一,而且在 PPP 途徑、生物合成和抗氧化代謝中具有重要調(diào)控作用。
輔酶ⅡNADP(H)含量試劑盒 輔酶Ⅱ

輔酶ⅡNADP(H)含量試劑盒說明書

分光光度法 50 管/24

輔酶ⅡNADP(H)含量試劑盒 輔酶Ⅱ

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義:

輔酶ⅡNADP(H)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,NADP+NADPH 含量測定可以計算NADP(NADPH + NADP+ )含量和 NADPH/NADP+比值,其變化與磷酸戊糖途徑和生物合成以及抗氧化反應(yīng)密切相關(guān)。NADPH/NADP+比值不僅是細(xì)胞氧化還原態(tài)的主要標(biāo)志之一,而且在 PPP 途徑、生物合成和抗氧化代謝中具有重要調(diào)控作用。

測定原理:

分別用酸性和堿性提取液提取樣品中 NADP+NADPH。NADPH 通過PMS 的遞氫作用,使氧化型噻唑藍(lán)(MTT)還原為甲瓚,570nm 下檢測吸光值,從而測定NADPH 含量。利用 6-磷酸葡萄糖脫氫酶還NADP+NADPH,從而檢測NADP+含量。

組成:

產(chǎn)品名稱

BF6001-50T/24S

Storage

提取液:酸性提取液

50ml

4℃

提取液:堿性提取液

50ml

4℃

試劑一:液體

15ml

4℃

試劑二:粉劑

1  

-20℃

試劑三:粉劑

1  

-20℃

試劑四:粉劑

1  

4℃

試劑五:液體

1.8ml

4℃

試劑六:液體

30ml

4℃

試劑七:液體

50ml

4℃

說明書

一份

試劑二:粉劑×1 支,-20 ℃保存,用時加入 4ml 蒸餾水,混勻;用不完的試劑 4℃保存一周;試劑三:粉劑×1 支,-20℃保存,用時加入 4ml 蒸餾水,混勻;用不完的試劑 4℃保存一周;試劑四:粉劑×1 支,4 ℃保存,用時加入 4ml 蒸餾水,混勻;用不完的試劑 4℃保存一周;

自備儀器和用品:

可見分光光度計、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 ml 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

NADP+和 NADPH 的提?。?/span>

1、 血清(漿)中 NADP+和NADPH 的提取

NADP+的提取:按照血清(漿)體積(ml):酸性提取液體積(ml)為 1:5~10 的比例(建議取約 0.1ml

血清(漿),加入 1ml 酸性提取液),95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μl 上清液,加入 500μl 堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

NADPH 的提?。喊凑昭澹{)體積(ml):堿性提取液體積(ml)為 1:5~10 的比例(建議取約 0.1ml

血清(漿),加入 1ml 堿性提取液),95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μl 上清液,加入 500μl 酸性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

2、組織中NADP+和NADPH 的提?。?/span>

NADP+的提?。喊凑战M織質(zhì)量(g):酸性提取液體積(ml)為 1:5~10 的比例(建議取約 0.1g 組織,加

入 1ml 酸性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μl 上清液,加入 500μl 堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

NADPH 的提?。喊凑战M織質(zhì)量(g):堿性提取液體積(ml)為 1:5~10 的比例(建議取約 0.1g 組織,

加入 1ml 堿性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μl 上清液,加入 500μl 酸性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

3 、細(xì)胞或細(xì)菌中 NADP+和NADPH 的提?。?/span>

NADP+的提?。合仁占?xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),棄上清,按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104 個):酸性提取液體

積(ml)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 酸性提取液),超聲波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次),95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μl 上清液,加入 500μl 堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

NADPH 的提取:先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),棄上清,按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104 個):堿性提取液體

積(ml)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 堿性提取液),超聲波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次),95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μl 上清液,加入 500μl 酸性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

測定步驟:

1、分光光度計預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長至 570nm,蒸餾水調(diào)零。

2、加樣表(在 1.5ml 棕色EP 管中按下表依次加樣):

試劑名稱(μl)

對照管

測定管

樣本

50

50

試劑一

250

250

試劑二

75

75

試劑三

75

75

 


試劑四

75

75


試劑五

35

35

試劑六

500

混勻,室溫避光靜置 20min

試劑六


500

充分混勻,靜置 5min 后,20000g,25℃離心 5min,棄上清,沉淀中加入:

試劑七

1000

1000

混勻,570nm 下比色,讀取對照吸光值A1 和測定管吸光值 A2,計算△A=A2-A1。

注意事項

1、如果一次性測定樣本數(shù)較多,可將試劑一、二、三和四按比例配成混合液。

2、對照管和測定管的測定步驟的區(qū)別:對照管加完試劑一、二、三、四和五后必須馬上加試劑六;測定管加完試劑一、二、三、四和五后必須反應(yīng) 20min 后再加試劑六。

3、反應(yīng)過程中注意避光。

4、若NADP+測定中△A(A2-A1)≤0.0144,NADPH 測定中△A(A2-A1)≤0.0259,說明樣本中輔酶含量較低,已低于檢測限,可做如下調(diào)整:(1)將測定管避光靜置時間 20min 延長到 60min;(2)在提取階段增加取樣量,即取 0.2g 樣本或 0.2ml 樣本加入 1ml 提取液。

5、由于每一個測定管需要設(shè)一個對照管,本試劑盒 50 管保證測 24 NADP+NADPH。

NADP+和 NADPH 含量的計算:

(一)NADP+含量的計算

標(biāo)準(zhǔn)條件下的回歸曲線為y = 0.197x + 0.0144,R2 = 0.9998;其中y 為△A,x NADP+濃度nmol/ml 1、血清(漿)NADP+含量計算

NADP+含量(nmol/ml)=[ (△A -0.0144)÷0.197×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 101.5×(△A -0.0144)

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NADP+含量計算 (1)按樣本蛋白濃度計算

NADP+ (nmol/mg prot)=[(△A -0.0144)÷0.197×V1) ]÷(V1×Cpr)= 5.1×(△A -0.0144)÷Cpr

按樣本鮮重計算

NADP+ (nmol/g 鮮重)= [(△A -0.0144)÷0.197×V1)] ÷(W×V1÷V2)=10.2×(△A -0.0144)÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

NADP+ (nmol/104 cell)=[(△A -0.0144)÷0.197×V1)] ÷(500×V1÷V2)=0.02×(△A -0.0144)

(二)NADPH 含量的計算

標(biāo)準(zhǔn)條件下的回歸曲線為y = 1.2396x + 0.0259,R2 = 0.9977;其中y 為△A,x NADPH 濃度nmol/ml 1、血清(漿)NADPH 含量計算

NADPH 含量(nmol/ml)= [(△A -0.0259)÷1.2396×V1)] ÷(V3×V1÷V2)= 16.1× (△A -0.0259)

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NADPH 含量計算

按樣本蛋白濃度計算

NADPH (nmol/mg prot)=[ (△A -0.0259)÷1.2396×V1)] ÷(V1×Cpr)= 0.8× (△A -0.0259)÷Cpr

按樣本鮮重計算

NADPH (nmol/g 鮮重)=[(△A -0.0259)÷1.2396×V1) ]÷(W×V1÷V2)=1.6× (△A -0.0259)÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

NADPH (nmol/104 cell)=[(△A -0.0259)÷1.2396×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.003× (△A -0.0259)

V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.05ml;V2:加入提取液體積,2ml;V3:加入血清(漿)體積:0.1ml; Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/ml;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬。

注意:最di檢測限為 0.01nmol/ml 0.01nmol/g 鮮重 或 0.001nmol/mg prot


輔酶ⅡNADP(H)含量試劑盒 輔酶Ⅱ

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