α-葡萄糖苷酶（α-Glucosidase, α-GC）試劑盒說明書

微量法 100 管/48 樣

α-葡萄糖苷酶試劑盒 糖代謝

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

α-GC(EC 3.2.1.20)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，催化水解芳基或烴基與糖基之間的α-糖苷鍵生成葡萄糖，不僅與細胞壁的松弛或加固有關，而且與細胞識別和一些信號分子產生密切相關。

測定原理：

α-GC 分解對-硝基苯-α-D 吡喃葡萄糖苷生成對-硝基苯fen，后者在 400nm 有最大吸收峰，通過測定吸光值升高速率來計算α-GC 活性。

組成：

試劑一：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 12ml 蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存。

自備儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提取：

1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進行冰浴勻漿。15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上，調節(jié)波長至 400nm，蒸餾水調零。

2、加樣表

充分混勻，放入 37℃準確水浴 30min 后，立即放入 95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失），流水冷卻后充分混勻（以保證濃度不變），8000g，4℃，離心 5min，取上清液（在 EP 管或 96 孔板中加入下列試劑）

充分混勻，室溫靜置 2min 后， 400nm 處測定吸光值A，計算ΔA=A 測定管-A 對照管。每個測定管需設一個對照管。

α-GC 活力計算：

用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準條件下測定的回歸方程為y = 0.00585x -0.0027；x 為標準品濃度（nmol/ml），y 為吸光值。

按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘產生 1nmol 對-硝基苯fen定義為一個酶活性單位。

α-GC 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V 反總]÷(V 樣×Cpr)÷T

=56.98×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g 組織每分鐘產生 1nmol 對-硝基苯fen定義為一個酶活性單位。

α-GC 活性(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=56.98×(ΔA+0.0027) ÷W

按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘產生 1nmol 對-硝基苯fen定義為一個酶活性單位。

α-GC 活性(nmol/min/104cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=0.114×(ΔA +0.0027)

V 反總：反應體系總體積，0.3ml；V 樣：加入反應體系中樣本體積，0.03ml；V 樣總：加入提取液體積， 1ml；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/ml；W：樣本質量，g； 500：細胞或細菌總數(shù)，500 萬；T：反應時間， 30min。

用 96 孔板測定的計算公式如下

標準條件下測定的回歸方程為y = 0.0039x -0.0027；x 為標準品濃度（nmol/ml），y 為吸光值。

按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘產生 1nmol 對-硝基苯fen定義為一個酶活性單位。

α-GC 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V 反總]÷(V 樣×Cpr)÷T

=85.47×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g 組織每分鐘產生 1nmol 對-硝基苯fen定義為一個酶活性單位。

α-GC 活性(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0027)÷0.0039×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=85.47×(ΔA+0.0027) ÷W

按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘產生 1nmol 對-硝基苯fen定義為一個酶活性單位。

α-GC 活性(nmol/min/104cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=0.171×(ΔA +0.0027)

V 反總：反應體系總體積，0.3ml；V 樣：加入反應體系中樣本體積，0.03ml；V 樣總：加入提取液體積， 1ml；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/ml；W：樣本質量，g； 500：細胞或細菌總數(shù)，500 萬；T：反應時間， 30min。

α-葡萄糖苷酶試劑盒 糖代謝