線粒體異檸檬酸脫氫酶（ICDHm）試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

線粒體異檸檬酸脫氫酶試劑盒 三羧酸

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

ICDHm（EC 1.1.1.41）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，在三羧酸循中催化異檸檬酸生成α-酮戊二酸，同時(shí)將 NAD⁺ 還原為NADH，是三羧酸循環(huán)的限速酶之一，其催化的反應(yīng)是細(xì)胞 NADH 主要來源之一。

測(cè)定原理：

ICDHm 催化NAD⁺ 還原生成NADH，導(dǎo)致 340nm 處光吸收上升。

組成：

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1、 稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細(xì)胞，加入 1ml 試劑一和 10μl 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、 將勻漿 600g，4℃離心 5min。

3、 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。

4、 上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的 ICDHm（此步可選做）。

5、 在步驟④的沉淀中加入 200μl 試劑二和 2μl 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次），用于線粒體 ICDHm 活性測(cè)定。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定

在試劑五中加入 18ml 試劑四充分溶解，置于 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 10min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

在試劑六中加入 1ml 蒸餾水，充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 樣本、10μl 試劑六和 180μl 試劑五，混勻，立即記錄 340nm

處 20s 時(shí)的吸光值A(chǔ)1 和 2min20s 后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

ICDHm 活性計(jì)算：

用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活性單位。

ICDHm 活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V 樣) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g 組織每分鐘生成 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活性單位。

ICDHm（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=325×ΔA÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活性單位。

ICDHm 活性（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.65×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，2min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。

用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活性單位。

ICDHm 活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g 組織每分鐘生成 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活性單位。

ICDHm（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T=650×ΔA÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘生成 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活性單位。

ICDHm 活性（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=1.3×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板光徑，0.5cm； V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，2min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。

線粒體異檸檬酸脫氫酶試劑盒 三羧酸