順烏頭酸酶（ACO）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法 100 管/96 樣

順烏頭酸酶ACO活性檢測(cè)試劑盒 三羧酸

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

順烏頭酸酶（aconitase），三羧酸循環(huán)中的酶，催化檸檬酸轉(zhuǎn)變?yōu)楫悪幟仕帷幟仕岜旧聿灰籽趸?，在順烏頭酸酶作用下，通過(guò)脫水與加水反應(yīng)，使羥基由β碳原子轉(zhuǎn)移到α碳原子上，生成易于脫氫氧化的異檸檬酸，為進(jìn)一步的氧化脫羧反應(yīng)作準(zhǔn)備。

測(cè)定原理：

ACO 催化檸檬酸轉(zhuǎn)化成異檸檬酸，異檸檬酸氧化脫羧將 NAD⁺ 還原生成NADH，導(dǎo)致 340nm 處光吸收上升。

組成：

試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存；臨用前加 1.5ml 蒸餾水充分溶解；現(xiàn)配現(xiàn)用

試劑七：粉劑×1 支，4°保存；臨用前加 12ml 試劑四充分溶解；

工作液：臨用前在 12ml 試劑七中加入 1ml 蒸餾水、1ml 試劑四、1ml 試劑五、1ml 試劑六充分混勻

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線(xiàn)粒體蛋白的分離：

1、 稱(chēng)取約 0.1g 組織或收集 500 萬(wàn)細(xì)胞，加入 1ml 試劑一和 10μl 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、 將勻漿轉(zhuǎn)入離心管內(nèi) 600g，4℃離心 5min。

3、 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。

4、 上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定胞質(zhì)順烏頭酸酶活性。

5、 在步驟④的沉淀中加入 200μl 試劑二和 2μl 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次），用于線(xiàn)粒體順烏頭酸酶活性測(cè)定。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定

（1）將工作液，置于 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 10min；現(xiàn)配現(xiàn)用；若分次用將工作液分裝后于-20°保存，一星期內(nèi)可用。

（3）在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 40μl 樣本 160μl 工作液，混勻，立即記錄 340nm 處 20s 時(shí)的吸光值A(chǔ)1 和 3min20s 后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

ACO 活性計(jì)算：

用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活性單位。

ACO 活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V 樣) ÷T=268×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g 組織每分鐘生成 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活性單位。

ACO（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=54×ΔA÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活性單位。

ACO 活性（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.108×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0.04 ml；V 樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，3min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。

用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活性單位。

ACO 活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=536×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g 組織每分鐘生成 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活性單位。

ACO（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T=108×ΔA÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘生成 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活性單位。

ACO 活性（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.216×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板光徑，0.5cm； V 樣：加入樣本體積，0.04 ml；V 樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，3min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。

順烏頭酸酶ACO活性檢測(cè)試劑盒 三羧酸