線粒體轉(zhuǎn)氫酶-1（TH-1）試劑盒說明書

分光光度法 50 管/48 樣

線粒體轉(zhuǎn)氫酶-1 TH-1試劑盒 氧化磷酸化

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

TH 位于線粒體的內(nèi)膜上，又稱為呼吸電子傳遞鏈復(fù)合體六，催化 NADH+NADP⁺和NAD⁺+NADPH相互轉(zhuǎn)化。催化正向反應(yīng)稱為 TH-1。線粒體 NADH 含量增加時(shí)會(huì)導(dǎo)致線粒體膜的H+電化學(xué)梯度升高，因而促進(jìn)了電子傳遞鏈上ROS 的產(chǎn)生。TH-1 促進(jìn)NADH 轉(zhuǎn)換為NADPH，從而提高線粒體的抗氧化能力。

測(cè)定原理：

NADH 和NADPH 均在 340nm 有特征吸收，因此TH 催化的轉(zhuǎn)氫反應(yīng)不能導(dǎo)致 340nm 吸光度發(fā)生變化。用人工合成底物 3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸（APADP⁺）替代NADP⁺，TH-1 催化 APADP⁺還原生成的APADPH 在 375nm 有特征光吸收，因此通過測(cè)定 375nm 光吸收增加速率，來計(jì)算 TH-1 活性。

試劑的組成和配制：

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1、準(zhǔn)確稱取 0.1g 組織或收集 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞，加入 1mL 試劑一，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、將勻漿 600g，4℃離心 5min。

3、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。

4、上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的TH-1（此步可選做）。

5、步驟 4 中的沉淀即為線粒體，加入 500uL 試劑二，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲3s，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次），用于TH-1 活性測(cè)定。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 375nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定

工作液的配制：臨用前取試劑三、試劑四和試劑五各一支，將試劑四、五轉(zhuǎn)移到試劑三中混合溶解，置于 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

在 1mL 玻璃比色皿中加入 100μL 樣本和 1000μL 工作液，混勻，立即記錄 375nm 處初始吸光值A(chǔ)1 和 10min 后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

TH-1 活性計(jì)算：

按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1 nmol APADPH 定義為一個(gè)酶活性單位。

TH-1 活性（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V 樣)÷T=164×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g 組織每分鐘產(chǎn)生 1 nmol APADPH 定義為一個(gè)酶活性單位。

TH-1 活性（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣÷V 樣總×W) ÷T=82×ΔA÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1 nmol APADPH 定義為一個(gè)酶活性單位。

TH-1 活性（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣÷V 樣總×500) ÷T=0.164×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1.1×10-3 L；ε：APADPH 摩爾消光系數(shù)，6.7×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.1 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.5mL；T：反應(yīng)時(shí)間，10 min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。

線粒體轉(zhuǎn)氫酶-1 TH-1試劑盒 氧化磷酸化