果糖-1,6-二磷酸酶(Fructose 1,6-bisphosphatase，F(xiàn)BP)試劑盒說(shuō)明書(shū)

分光光度法 50 管 48 樣

果糖-1,6-二磷酸酶試劑盒光合系列

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

果糖-1,6 二磷酸酶又稱(chēng)果糖 1,6 二磷酸酯酶，催化 1,6 二磷酸果糖和水生成 6 磷酸果糖和無(wú)機(jī)磷，在糖的異生代謝和光合作用同化物蔗糖的合成中起關(guān)鍵性的作用。

測(cè)定原理：

FBP 催化 1,6 二磷酸果糖和水生成 6 磷酸果糖和無(wú)機(jī)磷，在反應(yīng)體系中添加的磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和 6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化生成 6-磷酸葡萄糖酸和 NADPH，340nm 下測(cè)定NADPH 增加速率，即可計(jì)算 FBP 活性。

組成：

試劑一：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 40ml 試劑四充分溶解待用，用不完的試劑 4℃保存； 試劑二：液體 18μl×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 2.5ml 蒸餾水充分溶解待用，用不完的試劑 4℃保存；試劑三：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 2.5ml 蒸餾水充分溶解待用，用不完的試劑 4℃保存；

自備儀器和用品：

分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 ml 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水

樣本的前處理:

①總FBP 酶提?。航ㄗh稱(chēng)取約 0.1g 樣本，加入 1ml 提取液一，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴，200W，破碎

3s，間歇 7s，總時(shí)間 1min），然后 4℃，8000g 離心 10min，取上清測(cè)定。

②胞漿和葉綠體FBP 酶的分離：按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5～10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 樣本，加入 1ml 提取液一），冰浴勻漿后于 4℃，200g 離心 5min，棄沉淀，取上清在 4℃，8000g離心 10min，取上清用于測(cè)定胞漿 FBP 酶活性，取沉淀加 1ml 提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W，破碎 3s，間歇 7s，總時(shí)間 1min），然后 4℃，8000g 離心 10min，取上清測(cè)定葉綠體中FBP 酶活性。

建議測(cè)定總FBP 酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測(cè)定胞漿和葉綠體中的 FBP，則按照步驟②提取粗酶液。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、將試劑一、二、三 37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其它物種)預(yù)熱 10 分鐘

3、加樣表：

將上述試劑按順序加入 1 ml 石英比色皿中，立即混勻，加入最后一個(gè)試劑的同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，在 340 nm 波長(zhǎng)下記錄反應(yīng) 1min 后吸光度A1 和反應(yīng) 6min 后的吸光度A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

FBP 活性計(jì)算:

按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 的NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

FBP（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=321.5×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g 組織每分鐘生成 1 nmol 的NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

FBP（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=321.5×ΔA÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1×10-3 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.1 ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g。

果糖-1,6-二磷酸酶試劑盒光合系列