焦磷酸：果糖-6-磷酸-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶（Pyrophosphate: fructose-6 –phosphate-1-phosphoric acid transferase，PFP）試劑盒說明書

分光光度法 50 管/48 樣

焦磷酸果糖-6-磷酸-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶試劑盒光合

正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

焦磷酸：果糖-6-磷酸-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶（PFP，EC2.7.1.90）是一種胞質(zhì)酶，廣泛存在于植物組織中，催化果糖-6-磷酸與果糖-1,6-二磷酸之間的可逆轉(zhuǎn)化，在光合作用碳代謝中起重要作用。

測定原理：

PFP 催化 6-磷酸果糖轉(zhuǎn)化為 1,6-二磷酸果糖，它在醛縮酶和磷酸丙糖異構(gòu)酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)?3-磷酸甘油醛，再由 3-磷酸甘油醛脫氫酶和NADH 催化生成 3-磷酸甘油酸、NAD 和磷酸，340nm 處的吸光度變化反映了PFP 的活性的高低。

組成：

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃避光保存。臨用前加 5ml 蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑三：粉劑×1 瓶，-20℃避光保存。臨用前加 5 ml 蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑四：液體 0.5ml×1 瓶，4℃避光保存。試劑五：液體 0.5ml×1 瓶，4℃避光保存。試劑六：液體 5ml×1 瓶，4℃避光保存。

自備儀器和用品：

天平、低溫離心機(jī)、研缽、紫外分光光度計(jì)、1 ml 石英比色皿。

酶液提取：

組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g，加入 1ml 提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于 4℃，10000g 離心 10min，取上清置冰上待測。

細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入 1ml提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 4℃，10000g離心 10min，取上清置冰上待測。

液體：直接檢測。

測定步驟：

分光光度計(jì)預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

取 1ml 石英比色皿，依次加入 580μl 試劑一，100μl 試劑二，100μl 試劑三，10μl 試劑四，10μl 試劑五，100μl 試劑六，100μl 粗酶液，充分混勻，記錄 340nm 處10s 的吸光值A(chǔ)1 和310s 的吸光值A(chǔ)2，△A=A1-A2

計(jì)算公式：

按照樣本蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PFP（nmol/min/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V 反總÷(V 樣×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：每克組織每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PFP（nmol/min /g 鮮重）=ΔA÷（ε×d）×V 反總÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W

按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活單位定義：每 104 個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PFP（nmol/min /104 cell）= ΔA÷（ε×d）×V 反總÷(V 樣×細(xì)胞數(shù)量÷V 樣總) ÷T

=321.54×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量

按照液體體積計(jì)算

酶活單位定義：每毫升液體每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PFP（nmol/min /ml）=ΔA÷（ε×d）×V 反總÷V 樣÷T=321.54×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1ml；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0.1ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g

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