二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）試劑盒

分光光度法

二磷酸核酮糖羧化酶試劑盒 光合系列

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

二磷酸核酮糖羧化酶（EC 4.1.1.39）是植物光合作用中的一個關(guān)鍵酶，既控制著CO2 的固定，同時又制約著碳素向Calvin 循環(huán)和光呼吸循環(huán)分流，其活性的大小直接影響著光合速率。

測定原理：

（1）在Rubisco 的催化下，1 分子的核酮糖-1，5-二磷酸（RuBP）與 1 分子的CO2 結(jié)合，產(chǎn)生 2 分子的 3-磷酸甘油酸（PGA）；（2）PGA 可通過外加的 3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶的作用，產(chǎn)生甘油醛-3-磷酸，伴隨著NADH 氧化生成NAD+；（3）在 340 nm NADH 有特征吸收峰，而NAD+沒有此吸收峰，因此測定 340nm 吸光度下降速率可以代表Rubisco 的羧化酶活性。

組成：

BU6005-25T/24S 試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 12.5ml 試劑一，充分混勻待用；用不完的BU6005-25T/24S 試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

BU6005-25T/24S 試劑三：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 12.5ml 試劑一，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

BU6005-25T/24S 試劑四：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 1.25 ml 試劑一，充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

BU6005-50T/48S 試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 25ml 試劑一，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

BU6005-50T/48S 試劑三：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 25ml 試劑一，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

BU6005-50T/48S 試劑四：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 2.5 ml 試劑一，充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

（注意：試劑二、三、四溶解后，按需分裝-20℃保存。）自備儀器和用品：

可見-紫外分光光度計、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1ml 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液制備：

①總 Rubisco 酶提?。航ㄗh稱取約 0.1g 樣本，加入 1ml 提取液一，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴，200W，破碎 3s，間歇 7s，總時間 1min），然后 4℃，8000g 離心 10min，取上清測定。

②胞漿和葉綠體Rubisco 酶的分離：按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5～10 的比例（建議稱取約 0.1g 樣本，加入 1ml 提取液一），冰浴勻漿后于 4℃，200g 離心 5min，棄沉淀，取上清在 4℃， 8000g 離心 10min，取上清用于測定胞漿 Rubisco 酶活性，取沉淀加 1ml 提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W，破碎 3s，間歇 7s，總時間 1min），然后 4℃，8000g 離心 10min，取上清測定葉綠體中Rubisco 酶活性。

建議測定總Rubisco 酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測定胞漿和葉綠體中的Rubisco，則按步驟②提取粗酶液。

（照注意：粗酶液制備過程中超聲破碎操作使用細(xì)胞破碎儀進(jìn)行。）測定步驟：

1、分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

工作液的配制：臨用前將試劑二和試劑三 1：1 混合，用多少配多少；

在 1ml 石英比色皿中加入 50ul 樣本、50ul 試劑四和 900ul 工作液，混勻，立即記錄 340nm 處 20s

時吸光值A(chǔ)1 和 5min20s 時的吸光值A(chǔ)2，計算ΔA=A1-A2。

Rubisco 活性計算：

1、按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：25℃中 1 mg 蛋白 1 min 氧化 1 n mol NADH。

Rubisco（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T =643×ΔA÷Cpr 此法需要測定粗酶液中蛋白質(zhì)濃度，建議選購本公司生產(chǎn)的BCA 蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒。 2、按樣本鮮重計算

單位的定義：25℃中 1 g 組織 1 min 氧化 1 nmol NADH。

Rubisco（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣÷V 樣總×W) ÷T=643×ΔA÷W

上述計算公式中各符合含義：

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1×10-3 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0.05 ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應(yīng)時間，5 min；W：樣本質(zhì)量，g。

二磷酸核酮糖羧化酶試劑盒 光合系列