磷酸丙糖異構(gòu)酶（Triose-phosphate isomerase，TPI）試劑盒說(shuō)明書(shū)

分光光度法 50 管/48 樣

磷酸丙糖異構(gòu)酶試劑盒 光合系列

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

植物葉綠體中磷酸丙糖異構(gòu)酶是光合作用中參與 calvin 循環(huán)的重要酶。作用于磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮之間的轉(zhuǎn)化，磷酸二羥丙酮能快速透過(guò)葉綠體的包膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，并在其中逐步轉(zhuǎn)化為蔗糖。

測(cè)定原理：

磷酸丙糖異構(gòu)酶將磷酸二羥丙酮轉(zhuǎn)化為 3-磷酸甘油醛，3-磷酸甘油醛與NAD 在 3-磷酸甘油醛脫氫酶的作用下生成 3-磷酸甘油酸和NADH，340nm 處的吸光度變化反映了磷酸丙糖異構(gòu)酶的活性的高低。

組成：

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃避光保存。臨用前加 5ml 蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑三：粉劑×1 瓶，-20℃避光保存。臨用前加 5 ml 蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑四：粉劑×1 瓶，-20℃避光保存。臨用前加 5 ml 蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

自備儀器和用品：

天平、低溫離心機(jī)、研缽、震蕩儀、紫外分光光度計(jì)、1 ml 石英比色皿。

酶液提取

①總TPI 酶提取：建議稱(chēng)取約 0.1g 樣本，加入 1ml 提取液一，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇 7s，總時(shí)間 1min），然后 4℃，8000g 離心 10min，取上清測(cè)定。

②胞漿和葉綠體TPI 酶的分離：按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5～10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 樣本，加入 1ml 提取液一），冰浴勻漿后于 4℃，200g 離心 5min，棄沉淀，取上清在 4℃，8000g離心 10min，取上清用于測(cè)定胞漿 TPI 酶活性，取沉淀加 1ml 提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W，破碎 3s，間歇 7s，總時(shí)間 1min），然后 4℃，8000g 離心 10min，取上清測(cè)定葉綠體中TPI 酶活性。

建議測(cè)定總TPI 酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測(cè)定胞漿和葉綠體中的 TPI，則按照步驟②提取粗酶液。

測(cè)定操作:

分光光度計(jì)預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

取 1ml 石英比色皿，依次加入 600μL 試劑一，100μL 試劑二，100μL 試劑三，100μL 試劑四，100μL粗酶液，充分混勻，記錄 340nm 處 10s 的吸光值A(chǔ)1 和 310s 的吸光值A(chǔ)2，△A=A2-A1

計(jì)算公式:

按照樣本蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

TPI（nmol/min /mg prot）= ΔA÷（ε×d）×V 反總÷(V 樣×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：每克組織每分鐘生成 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

TPI（nmol/min /g 鮮重）= ΔA÷（ε×d）×V 反總÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1ml；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0.1ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g

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