一步克隆試劑盒

一步克隆試劑盒 克隆系列

產(chǎn)品貨號(hào)：CLO01

產(chǎn)品名稱(chēng)：一步克隆試劑盒

產(chǎn)品規(guī)格：20T/10μL/T/50T/10μL/T

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

NobleRyder® One Step Cloning Kit是一款簡(jiǎn)單、快速、高效的DNA定向克隆技術(shù)，可以將插入片段定向克隆至任意載體的任意位點(diǎn)?？梢愿咝Ъ嫒?-5個(gè)片段同源重組，50℃反應(yīng)10 - 30 min即可進(jìn)行連接，適用于快速克隆，DNA定點(diǎn)突變等。

實(shí)驗(yàn)流程

1.制備線性化載體

選擇合適的克隆位點(diǎn)，并對(duì)載體進(jìn)行線性化。盡量選擇無(wú)重復(fù)序列且載體克隆位點(diǎn)上下游20bp區(qū)域內(nèi)GC含量在40%-60%之間的位點(diǎn)進(jìn)行克隆。載體線性化方式有限制性?xún)?nèi)切酶酶切消化和反向PCR擴(kuò)增。1）酶切制備線性化載體時(shí)，推薦使用雙酶切線性化，線性化wan全5.1 制備線性化載體

選擇合適的克隆位點(diǎn)，對(duì)載體進(jìn)行線性化。選擇載體克隆位點(diǎn)附近無(wú)重復(fù)序列且上下游20bp區(qū)域內(nèi)GC含量在40%-60%之間的位點(diǎn)進(jìn)行克隆。

1）酶切制備線性化載體，推薦使用雙酶切方案；單酶切線性化并不影響無(wú)縫鏈接，但可能會(huì)有更多的環(huán)狀質(zhì)粒殘留，增加后期克隆的篩選難度。

2）反向PCR擴(kuò)增制備線性化載體，必須使用高保真DNA聚合酶進(jìn)行載體擴(kuò)增，以減少擴(kuò)增突變的引入。PCR產(chǎn)物需要進(jìn)行膠回收，減少環(huán)狀質(zhì)粒環(huán)狀DNA模板的殘留。

2.制備插入片段

通過(guò)在插入片段正、反向引物5，端引入15-25bp線性化載體末端同源序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5，端和3，端的末端分別帶有與線性化載體的兩個(gè)末端對(duì)應(yīng)的wan全一致的序列。使用高保真PCR Mix完成擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，并回收正確的產(chǎn)物片段。

插入片段正向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方式：

5’-上游載體末端同源序列+酶切位點(diǎn)（保留或刪除）+基因特異性正向擴(kuò)增引物序列-3’

插入片段反向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方式：

3’-基因特異性反向擴(kuò)增引物序列+酶切位點(diǎn)（保留或刪除）+下游載體末端同源序列-5’

3.線性化載體與插入片段濃度測(cè)定

使用NanoDrop或Qubit檢測(cè)線性化載體和插入片段的濃度。

4.重組反應(yīng)體系的配制

1）線性化載體和插入片段使用量計(jì)算

載體與插入片段摩爾比為1:2 ~ 1:3；當(dāng)插入片段長(zhǎng)度大于克隆載體時(shí)，將插入片段當(dāng)作克隆載體，克隆載體當(dāng)作插入片段計(jì)算。

2）在冰上配制反應(yīng)體系：

3）使用移液器輕輕吸打混勻并瞬時(shí)離心。

4）50℃反應(yīng)20min， 4℃維持或取出后置于冰上冷卻。

5）重組反應(yīng)轉(zhuǎn)化、涂板，具體方法參照感受態(tài)細(xì)胞的說(shuō)明書(shū)。

一步克隆試劑盒 克隆系列