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產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

市場(chǎng)上的基于堿變性法的質(zhì)粒提取試劑盒都是為提取大腸桿菌質(zhì)粒 DNA 的提取而開(kāi)發(fā)的，本試劑盒是以堿變性法為基礎(chǔ)、專(zhuān)門(mén)為農(nóng)桿菌質(zhì)粒 DNA 提取而開(kāi)發(fā)的。其過(guò)程是首先菌體經(jīng)離心懸浮后，被 SDS 和堿裂解，并且堿使基因組 DNA 和質(zhì)粒 DNA 變性，隨后用酸中和，質(zhì)粒 DNA 可以快速?gòu)?fù)性，而基因組 DNA 不能快速?gòu)?fù)性，故可以通過(guò)離心去除。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.專(zhuān)門(mén)為農(nóng)桿菌質(zhì)粒提取優(yōu)化，不適用于非農(nóng)桿菌。

2.適用于常見(jiàn)的穿梭質(zhì)粒和雙元質(zhì)粒，不適用于 pTi 或 pRi 等大型質(zhì)粒，提取這些質(zhì)粒DNA 需另購(gòu)本公司專(zhuān)門(mén)的相關(guān)產(chǎn)品。

3.快速、步驟少，整個(gè)操作在 40 分鐘左右完成。

4.溶液 B 中有藍(lán)色染料，便于目測(cè)非常關(guān)鍵的堿變性和中和反應(yīng)兩步的溶液混勻狀況， 保證實(shí)驗(yàn)效果。

5.產(chǎn)量高，每毫升過(guò)夜培養(yǎng)的菌液可以提取到 2-5 μg/mL（取決于質(zhì)粒是高拷貝、中拷貝還是低拷貝）。

6.本產(chǎn)品足夠 50 次微量提取，一次可以處理 4-5 mL 過(guò)夜培養(yǎng)的菌液。

7.純度高，采用本試劑盒提取的質(zhì)粒 A260/A280 在 1.8-2.0 之間，可以直接用于酶切、轉(zhuǎn)化、測(cè)序及PCR 等。

8.農(nóng)桿菌質(zhì)粒 DNA 純化試劑盒（沉淀法）只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

規(guī)格及成分

保存和運(yùn)輸

常溫運(yùn)輸和保存，RNase A 溶液需要-20℃保存低溫運(yùn)輸，有效期一年。

自備試劑

蒸餾水、75%乙醇

使用方法：

1.     實(shí)驗(yàn)前將農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA 純化溶液 A（下面簡(jiǎn)稱(chēng)溶液 A）和農(nóng)桿菌質(zhì)粒 DNA 純化溶液 C（下面簡(jiǎn)稱(chēng)溶液 C）放冰上預(yù)冷。第一次使用時(shí)把本試劑盒提供的細(xì)菌裂解增效劑全部加入到溶液A 中，輕柔混勻后待用。

2.從篩選平板上挑取農(nóng)桿菌單菌落至含抗生素的培養(yǎng)基中，28℃震蕩培養(yǎng) 12-16 小時(shí)（搖床轉(zhuǎn)速 200-300×g），使其 OD600 達(dá)到 1.0-1.2（剛進(jìn)入平臺(tái)期）。注意：建議使用 YEP 培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)更豐富的培養(yǎng)基會(huì)使菌體濃度過(guò)高，超過(guò)純化系統(tǒng)的處理能力而降低質(zhì)粒 DNA 的質(zhì)量。另外，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間會(huì)因細(xì)胞死亡、裂解而造成質(zhì)粒DNA 濃度降低。

3.用 1.5 mL 離心管收集 1.5 mL 過(guò)夜培養(yǎng)飽和菌液，4℃ 14,000×g 離心 1 分鐘，棄上清，再短暫離心，吸棄殘留液體。

4.再加入 1.5 mL 過(guò)夜培養(yǎng)飽和菌液，4℃ 14,000×g 離心 1 分鐘，棄上清，再短暫離心，吸棄殘留液體。

5.可以重復(fù)上步操作，直到累計(jì)得到 4-5 mL 菌液沉淀。

6.用 1 mL 自備的蒸餾水重懸細(xì)菌沉淀，14,000×g 離心 1 分鐘后棄上清。

7.在沉淀中加入 150 uL 冰上預(yù)冷的溶液 A，用槍頭充分吹打或漩渦振蕩使菌體充分重懸。如果細(xì)胞未充分懸浮將會(huì)嚴(yán)重影響后續(xù)堿變性，降低質(zhì)粒 DNA 回收率。

8.室溫放置 5 分鐘。

9.加入 300 uL 農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA 純化溶液 B（下面簡(jiǎn)稱(chēng)溶液B，如果溶液B 在低溫放置產(chǎn)生沉淀，須 37℃加熱溶解后冷卻到室溫方可使用。溶液 B 用后需要將蓋擰緊存放，否則空氣中的二氧化碳會(huì)進(jìn)入溶液，形成碳酸，中和溶液 B 中的堿，降低其效率。如果溶液 B 顏色不是藍(lán)色，則表示變質(zhì)，應(yīng)該棄之不用并且跟廠(chǎng)家聯(lián)系），溶液將變得粘稠。

10.溫和顛倒混勻 5-6 次（根據(jù)藍(lán)色的均勻程度判斷）后在冰上準(zhǔn)確放置 10 分鐘。注意： 此步不要?jiǎng)×艺袷?，冰上放置時(shí)間也不要超過(guò) 10 分鐘。

11.加入 250 uL 冰上預(yù)冷的溶液 C，溫和反復(fù)顛倒 4-6 次，溶液將變成無(wú)色，并有白色絮狀沉淀產(chǎn)生。

12.冰上放置至少 10 分鐘讓質(zhì)粒 DNA 復(fù)性。不能短于 10 分鐘。

13.4℃ 14,000×g 離心 10 分鐘，小心將上清液（只取 600 uL）轉(zhuǎn)移到一個(gè)新離心管中。此時(shí)的溶液比重較大，部分絮狀物懸浮在上清液中屬正?，F(xiàn)象，吸取上清時(shí)避開(kāi)這些懸浮物即可。

14.加入 10 uL 本試劑盒提供的RNase A 溶液（10 mg/mL），室溫放置 20 分鐘。

15.加入 600 uL 質(zhì)粒去蛋白溶液，渦旋震蕩器上充分震蕩 2 分鐘。

16.4℃ 14,000×g 離心 2 分鐘，將水相（無(wú)色部分）轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，不要取有顏色的相。

17.加等體積的核酸沉淀劑 B 型，顛倒 30 秒混勻后 4℃ 14,000×g 離心 15 分鐘，質(zhì)粒DNA 將形成沉淀，棄上清。

18.加入 1 mL 的自備 75%乙醇，室溫 14,000×g 離心 1 分鐘，棄上清。

19.室溫 14,000×g 離心半分鐘，用移液槍小心取出殘留液體（約 50 uL）。

20.室溫短暫放置半分鐘。

21.加入 50-100 uL DNA 洗脫液（基因組 DNA 專(zhuān)用）重懸沉淀，即得質(zhì)粒 DNA 溶液?？梢灾苯佑糜诤罄m(xù)實(shí)驗(yàn)。

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