糞便基因組DNA快速提取試劑he（離心柱型）

糞便基因組DNA快速提取試劑he（離心柱型）

目錄號(hào)：40213

v 適用范圍：

適用于快速提取各種糞便DNA

v 試劑盒組成、儲(chǔ)存、穩(wěn)定性：

本試劑盒在室溫儲(chǔ)存12個(gè)月不影響使用效果。

雜質(zhì)清除劑AB，短時(shí)間內(nèi)使用可以放室溫，長(zhǎng)期保存負(fù)-20℃。

儲(chǔ)存事項(xiàng):

1. 緩沖液ASL或者結(jié)合液CB低溫時(shí)可能出現(xiàn)析出和沉淀，可以在70℃水浴幾分鐘幫助重新充分溶解，恢復(fù)澄清透明后冷卻到室溫即可使用。

2. 雜質(zhì)清除劑AB常溫運(yùn)輸，短期一個(gè)月內(nèi)可4℃存放，-20℃長(zhǎng)期保存。

3. 為避免降低活性，方便運(yùn)輸，提供蛋白酶K為凍干粉狀，收到后，可短暫離心后，加入1毫升滅菌水溶解，因?yàn)榉磸?fù)凍融可能會(huì)降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量(20微升)分裝凍存，－20℃保存。

4. 避免試劑長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時(shí)蓋緊蓋子。

v 產(chǎn)品介紹：

常規(guī)的DNA純化方式并不能有效地去除糞便中存在的大量抑制因子而導(dǎo)致下游實(shí)驗(yàn)的失敗，如PCR不能擴(kuò)增出所需片段。該試劑盒采用DNA吸附柱和新型du特的溶液系統(tǒng)，能有效去除動(dòng)物糞便中各種影響下游實(shí)驗(yàn)（如PCR）的抑制因子，并能高效地回收糞便中的基因組DNA。動(dòng)物糞便樣品經(jīng)特殊緩沖液ASL重懸后，70℃處理5分鐘裂解細(xì)菌；離心去除不溶解的雜質(zhì)，蛋白酶K消化進(jìn)一步去除蛋白和雜質(zhì)；然后基因組DNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜， 再通過(guò)一系列快速的漂洗－離心的步驟，抑制物去除液和漂洗液將細(xì)胞代謝物、蛋白等雜質(zhì)去除，最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。

v 產(chǎn)品特點(diǎn)：

1. 離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜全部采用進(jìn)口*公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復(fù)性好?？朔藝?guó)產(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端。

2. 不需要使用有毒的苯fen等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。

3. 快速，簡(jiǎn)捷，單個(gè)樣品操作一般可在40分鐘內(nèi)完成。

4. 多次柱漂洗確保高純度，OD₂₆₀/OD₂₈₀典型的比值達(dá)1.7～1.9，可直接用于PCR，Southern-blot和各種酶切反應(yīng)。

v 注意事項(xiàng)：

1. 所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13,000rpm的傳統(tǒng)臺(tái)式離心機(jī)，如Eppendorf 5415C 或者類(lèi)似離心機(jī)。

2. 開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前將需要的水浴先預(yù)熱到70℃?zhèn)溆谩?/span>

3. 結(jié)合液CB和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。

4. 洗脫液EB不含有螯合劑EDTA， 不影響下游酶切、連接等反應(yīng)。也可以使用水洗脫， 但應(yīng)該確保pH大于7.5， pH過(guò)低影響洗脫效率。用水洗脫DNA應(yīng)該保存在－20℃。DNA如果需要長(zhǎng)期保存，可以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影響下游酶切反應(yīng)，使用時(shí)可以適當(dāng)稀釋。

5. PCR可能被過(guò)量的DNA（一般大于1μg）抑制，使用最小用量的洗脫DNA（適當(dāng)稀釋?zhuān)┓炊梢缘玫礁玫臄U(kuò)增。一般加入的洗脫DNA體積不要超過(guò)總PCR反應(yīng)體積的10％。我們建議在PCR反應(yīng)體系中加入終濃度0.1 μg/μl的BSA（牛血清白蛋白）有助于得到優(yōu)良擴(kuò)增效果。

v 操作步驟：（實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)先閱讀注意事項(xiàng)）

提示：第一次使用前請(qǐng)先在15ml漂洗液WB中加入60ml無(wú)水乙醇，充分混勻，加入后請(qǐng)及時(shí)在方框打鉤標(biāo)記已加入乙醇，以免多次加入!

1. 收集約200-220mg糞便到一個(gè)2ml離心管，置冰上。

如果是冰凍的標(biāo)本，加入緩沖液ASL前不能解凍，否則DNA容易降解。

2. 加1.4ml 緩沖液ASL，連續(xù)渦旋振蕩1分鐘或者直到wan全混勻均一。

注意wan全渦旋混勻，否則會(huì)嚴(yán)重降低產(chǎn)量。

3. 將重懸物70℃溫育5分鐘。

該加熱步驟可以提高3-5倍DNA產(chǎn)量，并且?guī)椭呀饧?xì)菌和寄生蟲(chóng)。對(duì)于某些難裂解的細(xì)胞（如革蘭氏陽(yáng)性菌）可以提高到95℃。

4. 渦旋振蕩15秒，室溫放置1分鐘。最高速離心1分鐘沉淀糞便顆粒。

5. 轉(zhuǎn)移900μl上清到一個(gè)1.5ml離心管，加入100μl雜質(zhì)清除劑AB，立刻渦旋振蕩1分鐘或者直到wan全混勻均一，室溫放置1分鐘。最高速離心3分鐘去除雜質(zhì)。

6. 轉(zhuǎn)移所有上清到一個(gè)1.5ml離心管，最高速離心3分鐘。

7. 轉(zhuǎn)移210μl上清到一個(gè)1.5ml離心管，加入20μl蛋白酶K (20mg/ml)溶液，充分混勻，加入200μl 結(jié)合液CB，渦旋振蕩15秒，充分混勻。70℃溫育10分鐘。

如果產(chǎn)量偏低，可以轉(zhuǎn)移更多的上清，并且相應(yīng)的按比例提高蛋白酶K和結(jié)合液的和后面的異丙醇使用量。

8. 冷卻后加入100μl 異丙醇，渦旋混勻。

9. 將上一步所得溶液和可能出現(xiàn)的沉淀都加入一個(gè)吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。

10. 加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm 離心30秒，棄廢液。

11. 加入700μl漂洗液WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇!），12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

12. 加入500μl漂洗液WB，12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

13. 將吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。

14. 取出吸附柱AC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100－150μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液可事先在 65-70℃水浴中預(yù)熱）， 室溫放置2分鐘，12,000rpm 離心1分鐘。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心1分鐘。

洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要DNA濃度較高，可以適當(dāng)減少洗脫體積， 但是最小體積不應(yīng)少于50μl，體積過(guò)小降低DNA洗脫效率，減少DNA產(chǎn)量。

15. DNA可以存放在2-8℃，如果要長(zhǎng)時(shí)間存放，可以放置在－20℃。

v 問(wèn)題與解決方法:

糞便基因組DNA快速提取試劑he（離心柱型）