miRNA RT-qPCR Detection kit

miRNA 反轉(zhuǎn)錄/熒光定量檢測(cè)試劑盒（All In One）

miRNA反轉(zhuǎn)錄/熒光定量檢測(cè)試劑盒 

目錄號(hào):71613

產(chǎn)品內(nèi)容

保存條件

-20℃保存，有效期 12 個(gè)月。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

本產(chǎn)品包含25 rxns (20 μl/rxn) 的miRNA逆轉(zhuǎn)錄（加尾法）和500 rxns (20 μl/rxn)的2x miRNA qPCR Mix。

本產(chǎn)品采用 Poly（A）加尾法，以miRNA為模板，采用特殊優(yōu)化預(yù)混合 miRNA RT Enzyme mix（包含Poly(A)加尾酶和反轉(zhuǎn)錄酶）將 Poly(A)加尾和反轉(zhuǎn)錄一步法高效完成 miRNA 對(duì)應(yīng)的 cDNA 合成；miRNA 檢測(cè)使用 2 x miRNA qPCR Mix（含有通用型 ROX）。適用于 Total RNA 或者 small RNA 等包含 miRNA 的樣品。

操作步驟：

一、miRNA 3’末端進(jìn)行Poly (A)加尾 和 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（第一鏈合成）

1. 冰上，在 RNase-Free PCR 管中，加入以下組分：(先加其他組分，最后再加入 miRNA RT Enzyme Mix)

注意事項(xiàng)：miRNA RT Enzyme Mix非常粘稠，溶液容易吸附在管壁和吸頭外，導(dǎo)致?lián)p失，用前請(qǐng)點(diǎn)甩離心，并且避免吸頭外壁沾附損失。Enzyme Mix內(nèi)酶都是過(guò)量的，即使每次按照 1.8μl使用，也不影響使用效果。

*在反應(yīng)中使用的total RNA 必須包含有小分子RNA(miRNA)。此過(guò)程也可以使用富集的miRNA，單純miRNA無(wú)法直接用分光光度計(jì)定量，建議直接加入2μl ~5μl?？筛鶕?jù)目的miRNA豐度決定加入量，但是對(duì)于低豐度miRNA 樣品而言(如血清血漿提取物)，可直接加入最大體積8 μl。

2. 輕柔吸打混勻，點(diǎn)甩離心，42℃孵育60 min，進(jìn)行miRNA加尾和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

3. 85℃加熱5 sec，終止反應(yīng)。合成的cDNA反應(yīng)液可放置于-20°C保存；也可以直接進(jìn)行下游qPCR檢測(cè)。

二、進(jìn)行miRNA的熒光定量檢測(cè)。

Forward Primer設(shè)計(jì)原則：(上游引物需要自備）

1. 遵循引物設(shè)計(jì)的zui普遍原則。

2. 以成熟的miRNA序列為基礎(chǔ)，將U替換成T，這是最基礎(chǔ)和zui簡(jiǎn)單的設(shè)計(jì)方法。

3. 試劑盒中提供的下游引物的Tm 值為65℃，設(shè)計(jì)上游引物的Tm值要盡量保證在65℃左右。

4. 若按照原則2 的方式直接設(shè)計(jì)的引物其Tm 值過(guò)低，可以在引物的5’端添加幾個(gè)堿基（最好為G 或C 堿基）；也可以在3’端添加1個(gè)或幾個(gè)A堿基；或者5’端和3’端同時(shí)修飾。

5. 若按照原則2 的方式直接設(shè)計(jì)的引物其Tm 值過(guò)高，可以在引物的5’或3’端去掉幾個(gè)堿基。

操作步驟：

1. 冰上配制qPCR反應(yīng)體系：（以20μl反應(yīng)體系為例）

1） 推薦模板加樣量為1-2μl，miRNA 第一鏈cDNA不應(yīng)超過(guò)總反應(yīng)體系的10%，對(duì)于特殊的檢測(cè)體系中，高含量的cDNA模板易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，根據(jù)所檢測(cè)miRNA的豐度適當(dāng)?shù)南♂宑DNA（10倍或者100倍）。

2） 通常推薦引物濃度為0.2 μM，就可以得到較好的結(jié)果，反應(yīng)效果不佳時(shí)可在0.1 - 1.0 μM范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)整。擴(kuò)增效率不高的情況下，可提高引物濃度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應(yīng)體系。

2. qPCR反應(yīng)程序

二步法特異性高，三步法擴(kuò)增效率高。

如果融鏈曲線較差，可以嘗試兩步法擴(kuò)增或提高退火溫度；如果因使用Tm值較低的引物等原因，得不到良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，可嘗試加長(zhǎng)延伸時(shí)間或者進(jìn)行三步法PCR擴(kuò)增。

miRNA反轉(zhuǎn)錄/熒光定量檢測(cè)試劑盒