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初級(jí)會(huì)員·13年您現(xiàn)在的位置： 首頁(yè)> 技術(shù)文章 > 清華大學(xué)張二荃團(tuán)隊(duì)揭示了RUVBL2調(diào)控真核生物鐘的分子調(diào)節(jié)機(jī)制！
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研究背景
晝夜節(jié)律廣泛存在于地球上的生物體中，在生物體響應(yīng)環(huán)境的晝夜變化、維持生理穩(wěn)態(tài)和健康中發(fā)揮著重要作用。晝夜節(jié)律紊亂可能會(huì)引發(fā)睡眠障礙、免疫力下降等疾病，威脅到人類健康。
在20世紀(jì)90年代，研究發(fā)現(xiàn)并提出，在晝夜節(jié)律的分子機(jī)制中，生物鐘（circadian clock）扮演著極其關(guān)鍵的角色。生物鐘是生物體內(nèi)調(diào)控生理和行為節(jié)律（約24小時(shí)周期）的核心機(jī)制，它通過(guò)轉(zhuǎn)錄-翻譯負(fù)反饋環(huán)路（transcription–translation feedback loop，TTFL）的形式實(shí)現(xiàn)計(jì)時(shí)功能，此分子機(jī)制在真核生物中高度保守。
TTFL的主要機(jī)制包含以下幾點(diǎn)
（1）轉(zhuǎn)錄因子與DNA啟動(dòng)子區(qū)域的順式元件結(jié)合，激活靶基因（包括自身抑制因子）的表達(dá)；
（2）抑制蛋白在胞質(zhì)中積累并轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核；
（3）核內(nèi)抑制蛋白與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，抑制其自身轉(zhuǎn)錄，形成約24小時(shí)的周期性振蕩。
這種TTFL模型，在多種真核生物鐘系統(tǒng)中具有普遍適用性。但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)該TTFL模型面臨諸多挑戰(zhàn)：①雖然該TTFL模型機(jī)制在真菌、植物和動(dòng)物等不同物種中表現(xiàn)出相似的結(jié)構(gòu)特征（結(jié)構(gòu)保守），但分子組成成分缺乏同源性（獨(dú)立進(jìn)化），暗示可能來(lái)源于不同的起源。②轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程需要消耗細(xì)胞約75%的能量，TTFL模型如何克服能量代謝障礙來(lái)維持高度有序的晝夜節(jié)律振蕩，目前還沒(méi)有解釋清楚。因此，研究試圖尋找并解釋真核生物鐘的分子機(jī)制，并探究真核生物與原核生物鐘的潛在共同特征。
研究目的
為研究真核生物鐘的分子機(jī)制，清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)交叉研究院張二荃團(tuán)隊(duì)課題組于2025年3月26日在國(guó)際頂尖學(xué)術(shù)期刊《Nature》（IF：50.5）上在線發(fā)表題為“The P-loop NTPase RUVBL2 is a conserved clock component across eukaryotes"的文章。
圖1.文章截圖（論文鏈接：doi.org/10.1038/s41586-025-08797-3）
文章揭示了P-loop NTP酶家族成員（AAA+（ATPases Associated with diverse cellular Activities））RUVBL2（又名RuvB-like 2）是真核生物中保守的時(shí)鐘成分，是真核生物鐘的共同核心成分，闡述了RUVBL2通過(guò)能量依賴的NTP酶活性調(diào)控生物鐘的分子機(jī)制，并證實(shí)了其在真核生物晝夜節(jié)律系統(tǒng)中具有進(jìn)化保守的核心調(diào)控功能。與藍(lán)藻生物鐘核心蛋白KaiC類似，RUVBL2表現(xiàn)出穩(wěn)定的低活性ATP酶特性，其催化效率（約13個(gè)ATP分子/天），較常規(guī)ATP酶（103-10?個(gè)ATP分子/天）顯著降低。這一發(fā)現(xiàn)也支持了最初在藍(lán)藻中發(fā)現(xiàn)的“緩慢ATP酶活性是生物鐘共同特征"的這一觀點(diǎn)。
圖2.循環(huán)振蕩系統(tǒng)的起源模型。該示意圖顯示了所研究的每個(gè)生物體的起源，起源于最后一個(gè)普遍共同祖先（LUCA）。周期長(zhǎng)度受KaiC或RUVBL ATP酶活性的調(diào)節(jié)（論文鏈接：doi.org/10.1038/s41586-025-08797-3）
研究創(chuàng)新點(diǎn)
提出全新假設(shè)：在遠(yuǎn)古生命起源階段，隨著原始生物鐘的出現(xiàn)，低活性的 P-loop ATP 酶成為生物鐘系統(tǒng)的核心組件。在藍(lán)藻中，KaiC 結(jié)合 KaiA 和 KaiB 組成了一個(gè)連接到 TTFL 的強(qiáng)大振蕩器，而在真核生物中，含有 P 環(huán)的 AAA+ ATP 酶 RUVBL2 及其同源蛋白通過(guò)與 TTFL 生物鐘蛋白相互作用，參與生物鐘調(diào)控。KaiC 和 RUVBL2 極低的 ATP 酶活性共同決定了生物鐘的 24 小時(shí)節(jié)律振蕩，這一機(jī)制或許是生物鐘系統(tǒng)進(jìn)化的共同特征。研究團(tuán)隊(duì)并對(duì)這一假設(shè)進(jìn)行一系列的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和論證。
突破傳統(tǒng)TTFL模型
傳統(tǒng)生物鐘研究聚焦于轉(zhuǎn)錄調(diào)控，而本研究揭示了AAA+ ATP酶通過(guò)能量依賴的分子伴侶功能調(diào)控時(shí)鐘蛋白復(fù)合物動(dòng)態(tài)，擴(kuò)展了生物鐘調(diào)控的分子機(jī)制。
進(jìn)化保守性的新證據(jù)
RUVBL2在真核生物中的廣泛保守性表明，能量代謝與生物鐘的偶聯(lián)可能是一種古老且普適的調(diào)控策略，為研究生物鐘起源提供了線索。
疾病關(guān)聯(lián)的潛在靶點(diǎn)
研究要點(diǎn)
RUVBL2是跨真核生物的生物鐘保守組分
通過(guò)多物種（哺乳動(dòng)物（小鼠成纖維細(xì)胞）、果蠅、植物（擬南芥）等）基因敲除實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)RUVBL2缺失導(dǎo)致晝夜節(jié)律周期紊亂（如小鼠成纖維細(xì)胞周期延長(zhǎng)、果蠅運(yùn)動(dòng)節(jié)律異常等）。
果蠅行為學(xué)實(shí)驗(yàn)（監(jiān)測(cè)運(yùn)動(dòng)節(jié)律）和植物開(kāi)花時(shí)間分析，驗(yàn)證跨物種表型保守性。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，RUVBL2在真核生物中高度保守，提示其功能在生物鐘調(diào)控中的古老起源以及進(jìn)化上的高度保守性。
RUVBL2通過(guò)NTP酶活性調(diào)控生物鐘
突變的RUVBL2（ATPase活性缺陷型）無(wú)法恢復(fù)敲除細(xì)胞的節(jié)律異常，表明其依賴NTP水解的酶活性對(duì)生物鐘功能至關(guān)重要。
進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，RUVBL2通過(guò)結(jié)合并水解ATP/GTP，調(diào)控核心時(shí)鐘蛋白（如CLOCK/BMAL1或同源蛋白）的構(gòu)象變化，影響其轉(zhuǎn)錄活性。
RUVBL2與生物鐘核心復(fù)合物的互作機(jī)制
免疫共沉淀（Co-IP）與蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，RUVBL2與生物鐘核心復(fù)合物（如CLOCK/BMAL1、PER/CRY）存在物理相互作用。
染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）分析RUVBL2對(duì)CLOCK/BMAL1靶基因（如Per、Cry）啟動(dòng)子結(jié)合的調(diào)控，RUVBL2通過(guò)維持時(shí)鐘蛋白復(fù)合物的動(dòng)態(tài)組裝（如促進(jìn)PER/CRY降解或CLOCK/BMAL1的激活），直接調(diào)控TTFL的周期性振蕩。
能量代謝與生物鐘的偶聯(lián)
RUVBL2的NTP酶活性可能作為細(xì)胞內(nèi)能量狀態(tài)的傳感器，將代謝信號(hào)（如ATP/ADP比率）與生物鐘調(diào)控偶聯(lián)，解釋生物鐘如何響應(yīng)營(yíng)養(yǎng)或能量脅迫。
總 結(jié)
研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)系統(tǒng)性遺傳篩選，獲得了RUVBL2的三種功能突變體：節(jié)律紊亂型、周期縮短型、周期延長(zhǎng)型。將這些突變體通過(guò)腺相關(guān)病毒載體遞送至小鼠視交叉上核（SCN）后，可顯著改變其自主運(yùn)動(dòng)活動(dòng)的晝夜節(jié)律模式。
生化分析證實(shí)這些表型變異均與ATP酶活性改變直接相關(guān)。酶動(dòng)力學(xué)分析表明，野生型RUVBL2的ATP水解活性極低，每日僅催化約13個(gè)ATP分子水解，其周轉(zhuǎn)率較典型ATP酶顯著降低。
RUVBL2 作為保守的低活性 ATP 酶，在調(diào)控真核生物鐘周期方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用，在人類、果蠅和真菌等不同真核生物鐘系統(tǒng)中均得到驗(yàn)證：①RUVBL2直系同源物與各物種核心時(shí)鐘蛋白存在保守的物理相互作用；②跨物種的RUVBL2突變均導(dǎo)致一致的節(jié)律表型。
使用抗癌藥物 CB-6644 抑制 RUVBL2 活性，可劑量依賴性延長(zhǎng)晝夜周期，為新型生物鐘調(diào)節(jié)劑的開(kāi)發(fā)提供新的方向。
綜上所述，該研究不僅確立了RUVBL2在真核生物晝夜節(jié)律系統(tǒng)中的核心地位，證實(shí)了 RUVBL2 作為核心生物鐘組分的作用，也揭示了慢速ATP酶活性這一最初在藍(lán)藻時(shí)鐘中發(fā)現(xiàn)的特征性機(jī)制，如何以類似 KaiC 的機(jī)制調(diào)節(jié)真核生物的晝夜節(jié)律，證實(shí)了其在真核生物中同樣具有進(jìn)化保守性，為理解生物鐘的分子進(jìn)化提供了新視角。
這一發(fā)現(xiàn)豐富了真核生物鐘的分子調(diào)節(jié)機(jī)制，深化了對(duì)生物鐘能量耦合機(jī)制的理解，也為靶向晝夜節(jié)律紊亂的干預(yù)策略提供了新思路，在進(jìn)化生物學(xué)和生物鐘研究領(lǐng)域具有重要意義。
翌圣助力產(chǎn)品
在該研究中，研究團(tuán)隊(duì)使用了翌圣生物Hygromycin B 潮霉素B（60225ES）進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染和篩選：
實(shí)驗(yàn)步驟
質(zhì)粒構(gòu)建
將野生型或突變的同源基因組克隆至攜帶潮霉素B抗性（# 60225ES，Yeasen Biotechnology）的PBS質(zhì)粒中，該質(zhì)粒攜帶潮霉素B基因，用于后續(xù)篩選。
電穿孔轉(zhuǎn)化
分生孢子（Conidia）制備：收集Ku70菌株的分生孢子（無(wú)性生殖孢子，易于遺傳操作）。
電穿孔轉(zhuǎn)化：通過(guò)Gene Pulser Xcell電穿孔系統(tǒng)施加高壓電脈沖，使孢子細(xì)胞膜暫時(shí)形成孔洞，允許外源質(zhì)粒DNA進(jìn)入細(xì)胞。使用Gene Pulser Xcell全功能電轉(zhuǎn)儀系統(tǒng)（Bio-Rad），將Ku70的分生孢子分別用野生型或突變型基因盒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并接種于含潮霉素B的瓊脂平板上。
轉(zhuǎn)化后處理：將孢子涂布在含潮霉素B的瓊脂平板上，僅成功整合質(zhì)粒（攜帶潮霉素抗性基因）的孢子能夠生長(zhǎng)。
篩選與驗(yàn)證
初篩（5天培養(yǎng)）：30°C黑暗條件下培養(yǎng)5天，篩選出潮霉素抗性菌落。在30℃黑暗條件下培養(yǎng)5天后，挑取單菌落至含潮霉素B的斜面培養(yǎng)基進(jìn)行基因型鑒定。隨后篩選出靶向突變株系，接種于race tube（節(jié)律檢測(cè)管）進(jìn)行生物節(jié)律檢測(cè)。
將race tube置于25℃持續(xù)光照條件下培養(yǎng)24小時(shí)，直至觀察到均勻生長(zhǎng)前沿（形成均勻生長(zhǎng)帶）。①對(duì)于持續(xù)黑暗（DD）條件，將race tube置于黑暗環(huán)境中培養(yǎng)數(shù)日，研究?jī)?nèi)源性生物鐘驅(qū)動(dòng)的自主節(jié)律；②對(duì)于光暗交替（LD）條件，采用12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的循環(huán)模式培養(yǎng)數(shù)日，模擬晝夜交替；③對(duì)于溫度循環(huán)條件，在持續(xù)黑暗環(huán)境下以25℃12小時(shí)/30℃12小時(shí)的溫度周期培養(yǎng)數(shù)日，研究溫度對(duì)生物鐘的影響。按時(shí)記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，使用ImageJ（v.1.53c）軟件分析并計(jì)算節(jié)律周期，評(píng)估RUVB2 S79I突變對(duì)生物鐘的影響。
產(chǎn)品推薦
產(chǎn)品名稱 | 貨號(hào) | 規(guī)格 |
Hygromycin B 潮霉素B | 60225ES03 | 1g |
60225ES10 | 10g |
