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產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

Hieff NGS^® Fast RNA Library Prep Kit for Illumina^®是用于Illumina®測序平臺的RNA測序文庫構建試劑盒，包含宿主（人）rRNA去除試劑，RNA反轉錄試劑，常規(guī)ds-cDNA合成試劑，轉座酶和優(yōu)化的緩沖體系，以及文庫擴增試劑。本產(chǎn)品利用專業(yè)開發(fā)設計的新一代轉座酶可以完成5~10 ng ds-cDNA建庫，簡化了操作流程，將建庫時間縮短到3 h。本試劑盒具有優(yōu)秀的文庫轉化率，可應用于多種臨床樣本的建庫。經(jīng)測序驗證，不同GC含量的樣本，均可獲得優(yōu)異的測序結果，文庫覆蓋度高，均一性好，偏好性低，使建庫變得更加簡單高效。提供的所有試劑都經(jīng)過嚴格的質量控制和功能驗證，保證了文庫構建的穩(wěn)定性和重復性。

產(chǎn)品組分

組分編號和名稱			12304ES08	12304ES24	12304ES96
12304-A		Random Primer & rRNA Removal Mix	16 μL	48 μL	192 μL
12304-B		1st Reaction Buffer	64 μL	192 μL	768 μL
12304-C		1st Strand Enzyme Mix	16 μL	48 μL	192 μL
12304-D		2nd Reaction Buffer	56 μL	168 μL	672 μL
12304-E		2nd Strand Enzyme Mix	24 μL	72 μL	288 μL
12304-F		5×Reaction Buffer	32 μL	96 μL	384 μL
12304-G		Transposome Mix V1	40 μL	120 μL	480 μL
12304-H		PCR Primer Mix	24 μL	72 μL	288 μL
12304-I		2×Ultima Amplification Mix	200 μL	600 μL	2×1200 μL
12304-J		N5 (N501)*	8 μL	——	——
12304-K		N7 (N701)*	4 μL	——	——
12304-L		N7 (N702)*	4 μL	——	——

運輸與保存方法

干冰運輸。-20℃保存。有效期1年。

注意事項

一、關于操作

1. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

2. 請于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。

3. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進行各步驟反應，使用前應預熱PCR儀至反應溫度附近。

4. 請使用無RNase污染的耗材，并對實驗區(qū)域定期進行清理，推薦使用ThermoFisher公司的RNAZapTM高效核酸去除噴霧去除RNA酶污染。

5. PCR產(chǎn)物因操作不當極容易產(chǎn)生氣溶膠污染，進而影響實驗結果準確性。推薦將PCR反應體系配制區(qū)和PCR產(chǎn)物純化檢測區(qū)進行強制性的物理隔離；配備文庫構建專用移液器等設備；定時對各實驗區(qū)域進行清潔（推薦使用ThermoFisher公司的DNAZapTM高效核酸去除噴霧），以保證實驗環(huán)境的潔凈度。

6. 本產(chǎn)品僅作科研用途！

二、關于產(chǎn)品原理

本產(chǎn)品基于轉座酶法開發(fā)，其核心原理是轉座酶及其轉座機制。在 Transposome Mix 中包含由轉座酶和兩種等摩爾的接頭Adapter 1和Adapter 2構成一個完整的轉座子。轉座發(fā)生時，該轉座子將 Adapter 1 和 Adapter 2 接頭序列插入靶基因中，形成一端帶有Adapter 1，一端帶有 Adapter 2 的 DNA，之后利用DNA聚合酶將轉座形成的切口補齊。這種產(chǎn)物經(jīng) N5 (N5XX)和N7 (N7XX)以及 P5 和 P7 (PCR Primer Mix)兩對引物擴增，產(chǎn)物經(jīng)分選和純化后即為可測序文庫。

圖1   Transposome的工作原理

三、關于ds-cDNA的片段化

1. 本試劑盒適用5~10 ng Input ds-cDNA。在 Input ds-cDNA 投入前，使用基于雙鏈 DNA 熒光染料的方法，如 Qubit® ，PicoGreen®等進行定量。【注：Transposome Mix 對 DNA 濃度非常敏感，所以準確的 DNA 濃度測定對實驗成功與否至關重要。】

四、DNA磁珠純化與分選 (Bead-based Clean Up and Size Selection)

1. 建庫過程中有多個步驟需要使用DNA純化磁珠，我們推薦使用Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)進行DNA純化和分選。

2. 磁珠使用前應先平衡至室溫，否則會導致得率下降、分選效果不佳。

3. 磁珠每次使用前都應充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。

4. 轉移上清時，請勿吸取磁珠，即使微量殘留都將影響后續(xù)文庫質量。

5. 磁珠洗滌使用的80%乙醇應現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率。

6. 產(chǎn)物洗脫前應將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇殘留影響后續(xù)反應；過分干燥又會導致磁珠開裂進而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥。

7. DNA純化或長度分選產(chǎn)物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脫，產(chǎn)物于4°C可保存2天，-20°C可保存1個月。

五、關于文庫質檢 (Library Quality Analysis)

1. 通常情況下，構建好的文庫可通過長度分布檢測和濃度檢測來進行質量評價。

2. 文庫濃度檢測可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit®、PicoGreen®等；基于qPCR絕對定量的方法。

3. 推薦使用qPCR方法進行文庫濃度檢測：Qubit®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測定方法時，無法有效區(qū)分單端連接Adapter的產(chǎn)物、兩端均未連接Adapter的產(chǎn)物及其他不完整雙鏈結構產(chǎn)物；qPCR絕對定量基于PCR擴增原理，僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫（即可測序的文庫），可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測序文庫的干擾。

4. 文庫濃度檢測不可使用：基于光譜檢測的方法，如NanoDrop®等。

5. 文庫長度分布檢測，可通過Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細管電泳或微控流原理的設備進行檢測。

六、自備材料 (Other Material)

1. DNA純化磁珠：Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP Beads (A63880)或其他等效產(chǎn)品。

2. N5 (N5XX)和N7 (N7XX) Index引物：Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina® (96 Index) (Cat#12610ES96)。

3. 文庫質檢：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效產(chǎn)品；文庫定量試劑。

4. 其他材料：無水乙醇、無菌超純水、低吸附槍頭、PCR管、磁力架、PCR儀等。

建庫流程

圖2 極速 RNA建庫操作流程

使用方法

Step 1 宿主rRNA的去除

1. 將 Random Primer & rRNA Removal Mix室溫解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。按照下表配置反應液：

表1 宿主rRNA去除反應體系

2. 使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應液離心至管底。

3. 將上述PCR管置于PCR儀中，按照表2所示設置反應程序，進行RNA的預變性。

表2 宿主rRNA去除反應程序

Step 2 第一鏈cDNA的合成 (1st Strand Synthesis)

1. 將第一鏈合成試劑從-20°C取出，室溫解凍，顛倒混勻后瞬離。按表6所示，配制第一鏈cDNA合成的反應液。

表3 第一鏈cDNA合成反應體系

2. 使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應液離心至管底。

3. 將上述PCR管置于PCR儀中，按照表4所示設置反應程序，進行第一鏈cDNA的合成。反應結束后立即進行第二鏈cDNA的合成。

表4第一鏈cDNA合成反應程序

Step 3第二鏈cDNA的合成 (2nd Strand Synthesis)：

1. 將第二鏈合成試劑從-20 °C取出，解凍后顛倒混勻；按照表5所示，配制第二鏈cDNA合成反應液。

表5 第二鏈cDNA合成反應體系

2. 使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應液離心至管底。

3. 將上述PCR管置于PCR儀中，按照表6所示設置反應程序，進行第二鏈cDNA的合成。

表6 第二鏈cDNA合成反應程序

Step4 cDNA產(chǎn)物純化 (Post Ligation Clean Up)

1. 準備工作：將Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取21 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads (0.6×，Beads:DNA=0.6:1)至第二鏈cDNA產(chǎn)物中，渦旋或吹打混勻，室溫孵育5 min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重復步驟5，總計漂洗兩次。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過5 min）。

8. 將PCR管從磁力架中取出，加入14 μL ddH2O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約3 min），小心移取12 μL上清至新PCR管中，取1 μL的純化測第二鏈cDNA產(chǎn)物進行Qubit 定量，進行轉座酶的片段化。

Step 5 DNA段化 (DNA Tagment)

1. 準備工作：將 Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。將5×Reaction Buffer 室溫解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于無菌 PCR 管中配制表 7 所示反應體系。

表7 片段化反應體系

3. 使用移液器輕輕吹打或低速振蕩混勻，并短暫離心將反應液離心至管底。

4. 將上述PCR管置于PCR儀，設置表8所示反應程序，進行DNA段化，末端修復及dA尾添加反應。

表8 片段化的反應程序

Step 6 文庫擴增 (Library Amplification)

該步驟將對純化或長度分選后的接頭連接產(chǎn)物進行PCR擴增富集。

1. 將表8中的試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于無菌PCR管中配制表9所示反應體系。

表9  文庫擴增PCR反應體系

【注】：*Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina® (96 Index)（Cat#12610ES96）中提供8種N5XX和12種N7XX，可根據(jù)樣品數(shù)量和Index選擇策略自行選擇。

3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應液收集至管底。

4. 將PCR管置于PCR儀中，設置表10示反應程序，進行PCR擴增。

表10  文庫擴增PCR擴增反應程序

【注】：*此步不可省略。轉座反應產(chǎn)物并非完整的雙鏈 DNA，72℃孵育3 min用于生成成熟的PCR模板。

**循環(huán)數(shù)請根據(jù)測序需要進行選擇。起始 DNA 量為 5-10 ng 時，推薦 13-15 個擴增循環(huán)。

Step 7 擴增產(chǎn)物磁珠純化 (Post Amplification Clean Up)

1. 準備工作：將Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取45 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads (0.9×，Beads:DNA=0.9:1)至PCR產(chǎn)物中，渦旋或吹打混勻，室溫孵育5 min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重復步驟5，總計漂洗兩次。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過5 min）。

8. 將PCR管從磁力架中取出，加入21 μL ddH2O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約3 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，進行文庫定量、質檢。

Step 8 文庫質量控制

通常情況下，構建好的文庫可通過濃度檢測和長度分布檢測來進行質量評價，具體請參見注意事項五。

附錄

使用Hieff NGS® Fast RNA Library Prep Kit for Illumina®對50 ng ~500 ng 293 RNA樣本建庫，使用0.9×磁珠進行PCR后純化，結果使用Agilent 2100 Bioanalyzer進行檢測。

圖3 極速 RNA建庫峰圖

HB220117