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產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

細(xì)胞增殖檢測(cè)是評(píng)估細(xì)胞健康程度、遺傳毒性及抗腫瘤藥物效果的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)手段。常用的檢測(cè)細(xì)胞增殖方法是BrdU法。EdU法檢測(cè)是Brdu方法的升級(jí)和突破。EdU（5-溴-2-脫氧尿嘧啶）是一種嘧啶類似物，可在DNA合成期整合入DNA雙鏈。EdU法檢測(cè)是基于“點(diǎn)擊"反應(yīng)，一種由銅催化的疊氮化合物和炔烴的原子共價(jià)反應(yīng)。

試劑盒中EdU試劑含有炔烴，而Yefluor 488 Azide染料試劑含有疊氮化合物。點(diǎn)擊法的EdU標(biāo)記增殖快速有效，易于使用。只需少量的疊氮化染料即可有效地標(biāo)記出整合的EdU。標(biāo)準(zhǔn)化的戊二醛固定和去污劑促滲可以使檢測(cè)試劑進(jìn)入細(xì)胞，而B(niǎo)rdu方法則需要DNA變性（如酸變性、熱變性或者用DNase消化）去暴露BrdU從而方便BrdU抗體結(jié)合。

本試劑盒包含EdU法檢測(cè)所需要的所有組份，可以檢測(cè)細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期分析。對(duì)于細(xì)胞周期的分析，試劑盒提供了細(xì)胞核染料Hoechst 33342。

光譜特性：Yefluor 488 Azide：Ex/Em=495/519 nm；Hoechst 33342：Ex/Em=350/461nm, bound to DNA。

產(chǎn)品組分

運(yùn)輸與保存方法

冰袋（wet ice）運(yùn)輸。-20℃避光保存，有效期1年。

注意事項(xiàng)

1．為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

2．本產(chǎn)品僅作科研用途！

其他所需試劑

10 mM PBS, pH7.2-7.6

中性多聚甲醛固定液（4%多聚甲醛 in PBS ）

2 mg/ml 甘氨酸溶液（去離子水配制）

促滲試劑（0.5% Triton X-100 in PBS）

3% BSA in PBS, pH7.2-7.6

去離子水

18×18 mm 蓋玻片

使用方法

1、EdU標(biāo)記細(xì)胞

注意：EdU的標(biāo)記濃度應(yīng)根據(jù)所用的細(xì)胞類型做相應(yīng)的優(yōu)化選擇，推薦客戶以10 μM的EdU初始濃度進(jìn)行摸索。細(xì)胞培養(yǎng)基、細(xì)胞生長(zhǎng)密度及細(xì)胞類型和其他實(shí)驗(yàn)條件都有可能影響細(xì)胞的標(biāo)記效果。預(yù)實(shí)驗(yàn)中我們建議客戶設(shè)置一系列的EdU濃度梯度，以確定最佳的合適您的細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)濃度。

1.1. 以每孔4×10³-1×10⁵細(xì)胞接種于96孔板中，進(jìn)行您所需要的藥物處理或者其他刺激處理。

1.2. 準(zhǔn)備一份2×的EdU工作液（組分A）：以*培養(yǎng)基稀釋10 mM的儲(chǔ)液至合適的工作濃度。建議您以10 μM的初始工作濃度開(kāi)始預(yù)實(shí)驗(yàn)。

1.3. 預(yù)熱2×的EdU工作液，加入等體積的培養(yǎng)基，使?jié)舛茸優(yōu)?×(如：需要得到10 μM的終濃度，應(yīng)以新鮮培養(yǎng)基等體積加入到20 μM的EdU工作液中)。

1.4. 合適時(shí)間合適條件孵育細(xì)胞，EdU孵育細(xì)胞的時(shí)間可以直接用作測(cè)定細(xì)胞DNA合成的指標(biāo)，時(shí)間點(diǎn)選擇以及孵育時(shí)間的長(zhǎng)度取決于細(xì)胞生長(zhǎng)速率。通過(guò)短暫的EdU孵育進(jìn)行的脈沖式標(biāo)記細(xì)胞可以用于研究細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)。

2、細(xì)胞固定及促滲操作

2.1. 孵育完成后，去除培養(yǎng)基加入50 μL 4%中性多聚甲醛至各個(gè)孔，室溫孵育15-30 min后，去除固定液。

2.2. 每孔加入50 μL 2 mg/mL甘氨酸溶液，室溫孵育5 min，中和殘留的固定液。

2.3. 以每孔0.1 mL 3% BSA in PBS的洗滌液洗滌細(xì)胞2次。

2.4. 去除洗滌液，加入0.1 mL 0.5% Triton X-100 in PBS到每個(gè)孔中，室溫孵育20 min。

注意：本參考步驟是針對(duì)以4%中性多聚甲醛固定且以0.5% Triton X-100促滲操作樣本而優(yōu)化的操作方法，但本參考所介紹的步驟同樣可用于其他類似操作的樣本，如以甲醇固定以皂苷固定的樣本等。

3、EdU檢測(cè)

注：本參考步驟每孔反應(yīng)使用100μL的Click-iT反應(yīng)混合物。用戶可根據(jù)自己的樣本情況調(diào)整等比例減少所用的溶液體積。

3.1. 準(zhǔn)備1× Click-iTEdU反應(yīng)緩沖液（組分C）：10×組分C試劑以去離子水稀釋10倍即可。

3.2. 制備一份5×的Click-iTEdU反應(yīng)添加物儲(chǔ)液（組分E）：加0.3 mL去離子水至30 mg的E組分試管中（100 mg/mL），混勻至全部溶解。使用后，剩余儲(chǔ)液存放在≤-20℃，可保存一年，溶液一旦呈現(xiàn)棕色，則說(shuō)明有效成分降解不能再用（注意：不同規(guī)格的組分E均按照此比例加去離子水溶解為5×儲(chǔ)液備用）。

3.3. 準(zhǔn)備1× Click-iTEdU緩沖液添加物：以去離子水稀釋5×儲(chǔ)液（組分E）至1×，溶液應(yīng)新鮮配置，當(dāng)天用完。

3.4. 依據(jù)表1準(zhǔn)備Click-iT反應(yīng)混合物。表1要求添加的組分對(duì)于反應(yīng)來(lái)說(shuō)非常重要，否則反應(yīng)無(wú)法有效進(jìn)行。

表1 Click-iT反應(yīng)混合物

3.5. 去除促滲劑，以每孔0.1 mL的3% BSA in PBS的洗滌液洗滌2次，去除洗滌液。

3.6. 加入0.1 mL Click-iT反應(yīng)混合物至每個(gè)孔，簡(jiǎn)短搖晃培養(yǎng)板以確保反應(yīng)混合物可以均勻覆蓋細(xì)胞。

3.7. 室溫避光孵育30 min。

3.8. 除去反應(yīng)混合物，每孔以0.1 mL 3% BSA in PBS洗滌兩次，去除洗滌液。

對(duì)于核染色，可以進(jìn)行DNA復(fù)染。如其他無(wú)特別要求，即可進(jìn)行拍照分析。

4、DNA復(fù)染（可選）

4.1. 以0.1 mL PBS洗滌每孔1次，去掉洗滌液。

4.2. 以PBS稀釋Hoechst 33342（組分F）儲(chǔ)液1:2,000至1× Hoechst 33342溶液，終濃度為5 µg/mL。

4.3. 每孔加0.1 mL 1× Hoechst 33342溶液，室溫避光孵育15-30 min。除去Hoechst 33342溶液。

4.4. 0.1 mL PBS洗滌每孔2次，去除洗滌液。

HB220418