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產(chǎn)品簡(jiǎn)介

支原體PCR檢測(cè)試劑盒（巢式PCR）(2G)是基于巢式PCR法(NestedPCR)對(duì)各種生物材料（如細(xì)胞培養(yǎng)物、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分泌物和動(dòng)物血清等）支原體感染的檢測(cè)。該試劑盒采用定量PCR技術(shù)，針對(duì)支原體16S-23S rRNA序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)兩套引物，進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增，以第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物為準(zhǔn)進(jìn)行支原體污染情況判斷。其可檢出包括口腔支原體(M.orale)、肺炎支原體(M.pneumoniae)、豬鼻支原體(M.hyorhinis)、精氨suan支原體(M.arginini)、雞敗血支原體(M.gallisepticum)、關(guān)節(jié)液支原體(M.synoviae)、發(fā)酵支原體(M.fermentans)、檸檬螺原體(Spiroplasma citri)、唾液支原體(M.salivarium)等在內(nèi)的共34種支原體，靈敏度可達(dá)2.5 copies/uL，對(duì)于10 CFU/mL支原體標(biāo)準(zhǔn)菌株也可正常擴(kuò)增有條帶，具備特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作方便快速等特點(diǎn)，可直接用于細(xì)胞培養(yǎng)上清液的檢測(cè)。

本產(chǎn)品相較于常規(guī)PCR法支原體檢測(cè)試劑盒，可避免由于引物與模板之間的非特異配對(duì)，導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生；還可靈敏的檢測(cè)到樣本中微量的支原體DNA，避免假陰性的產(chǎn)生。

產(chǎn)品信息

組分信息

*PCR反應(yīng)極其靈敏，為防止假陽(yáng)性，加樣時(shí)，最后加陽(yáng)性對(duì)照。

**40614-C：Positive Control Template，陽(yáng)性對(duì)照。

運(yùn)輸和儲(chǔ)存條件

干冰運(yùn)輸，-25~-15℃保存，有效期1年。

*整個(gè)試劑盒若較長(zhǎng)時(shí)間不用，請(qǐng)避光保存。其中40614-C長(zhǎng)期不用時(shí)，可-85~-65℃冷凍保存。

使用說(shuō)明

1. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1）提前準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)所需試劑耗材：

如：瓊脂糖凝膠、電泳緩沖液、DNA marker等試劑和移液槍、無(wú)菌吸頭、離心管等耗材。

2）自備實(shí)驗(yàn)所需設(shè)備和儀器：

如：漩渦振蕩器、PCR儀、微量離心機(jī)、電泳儀等。

2. 實(shí)驗(yàn)方法

1）待測(cè)樣本類(lèi)型：

a. 本試劑盒可以直接檢測(cè)細(xì)胞上清、血清和培養(yǎng)基，以及細(xì)胞DNA等。細(xì)胞培養(yǎng)3-6天后，直接取其上清液進(jìn)行PCR反應(yīng)。為排除細(xì)胞培養(yǎng)基抑制PCR反應(yīng)，陽(yáng)性對(duì)照中需加入等量的細(xì)胞上清液。

b. 對(duì)于細(xì)胞懸液類(lèi)樣本，則需要先經(jīng)過(guò)樣本前處理，提取總DNA后，才可進(jìn)行檢測(cè)。

2）實(shí)驗(yàn)結(jié)果判讀：

本試劑盒需要進(jìn)行兩輪PCR反應(yīng)：第一輪PCR結(jié)束后，取其反應(yīng)產(chǎn)物作為第二輪PCR的模板，根據(jù)兩輪PCR產(chǎn)物電泳條帶之有無(wú)及片段大小來(lái)分析結(jié)果（第一輪陽(yáng)性對(duì)照PCR條帶大小為389bp、第二輪陽(yáng)性對(duì)照PCR條帶大小為247bp）。其中，應(yīng)以第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果為準(zhǔn)，進(jìn)行有無(wú)支原體污染的判斷。

3）第一輪PCR：

a. 充分融解GMyc-1st PCR Mix（40614-A），按下列表格配制反應(yīng)液：

表1 第一輪PCR反應(yīng)體系

*為防止40614-C污染，請(qǐng)先將陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組加樣完成后，再將40614-C加入陽(yáng)性對(duì)照組。

b. 按下述條件進(jìn)行PCR反應(yīng)：

普通程序

94℃         5 min

94℃         30 sec

62℃         30 sec   30 cycles

72℃         30 sec

72℃         7 min

快速程序*

95℃         5 min

95℃         15 sec

60℃         30 sec26 cycles

*快速程序能夠縮短反應(yīng)時(shí)間，但對(duì)于靈敏度會(huì)略有影響，可自行選擇使用普通程序或者快速程序。

4）第二輪PCR：

a. 充分融解GMyc-2nd PCR Mix（40614-B），按下列表格配制反應(yīng)液：

表2 第二輪PCR反應(yīng)體系

*第一輪PCR反應(yīng)液需經(jīng)10倍稀釋后，方可作為第二輪PCR的模板。

b. 按下述條件進(jìn)行PCR反應(yīng)：

普通程序（總時(shí)長(zhǎng)90min）

94℃         5 min

94℃         30 sec

62℃         30 sec   30 cycles

72℃         30 sec

72℃         7 min

快速程序*（總時(shí)長(zhǎng)48min）

95℃         5 min

95℃         15 sec

60℃         30 sec26 cycles

*快速程序靈敏度為5copies/µL，普通程序靈敏度為2.5 copies/µL,可以根據(jù)需要切換程序，常規(guī)情況推薦普通程序，且不同程序的循環(huán)數(shù)不請(qǐng)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

c. 反應(yīng)結(jié)束后，取7~10 μL的PCR反應(yīng)液*（無(wú)需加Loading Buffer），直接進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物**。

*以本輪（即第二輪）擴(kuò)增產(chǎn)物為準(zhǔn)進(jìn)行支原體污染情況判斷。

**根據(jù)PCR產(chǎn)物電泳條帶之有無(wú)及片段大小來(lái)分析結(jié)果（第二輪陽(yáng)性對(duì)照PCR條帶大小為247bp）。

5）本試劑盒的推薦使用頻率：

注意事項(xiàng)

1. 本產(chǎn)品僅作科研用途。

2. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。

3. 使用本試劑前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)，實(shí)驗(yàn)應(yīng)規(guī)范操作，包括樣本處理、反應(yīng)體系的配制及加樣。

Ver.CN20241125