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產(chǎn)品簡介

rProtein A/G IP/Co-IP kit (蛋白A/G免疫（共）沉淀試劑盒)是一種通過高質(zhì)量的重組Protein A/G磁珠，配合用戶自備的特異性抗體，進行目的蛋白免疫沉淀或免疫共沉淀的試劑盒。本試劑盒包含足夠完成40個反應(yīng)的試劑，每個反應(yīng)使用25 uL磁珠，同時可進行10個陰性對照。

rProtein A/G免疫沉淀磁珠使用“納米表面生物技術(shù)"(S-TEC)，將rProtein A/G高密度定向包被到粒徑為200 nm的納米磁珠表面，納米級磁珠提供的超大比表面積，具有更多的結(jié)合位點、更高的抗體結(jié)合能力和極低的蛋白非特異性吸附率。蛋白A/G免疫（共）沉淀試劑盒配有經(jīng)過優(yōu)化驗證的必要試劑，為免疫（共）沉淀實驗提供了最佳的反應(yīng)條件，增強了免疫（共）沉淀實驗的穩(wěn)定性。本產(chǎn)品可廣泛應(yīng)用于細胞裂解物、細胞分泌上清、血清、腹水等樣品中抗原的免疫（共）沉淀反應(yīng)。

天然蛋白A（Protein A）是一種發(fā)現(xiàn)于金黃色//葡萄//球菌的細胞壁表面蛋白，天然蛋白G（Protein G）是一種分離自G型或C型鏈球菌屬的細胞表面蛋白，二者功能相似，主要通過與免疫球蛋白（Ig）的Fc區(qū)相互作用，可結(jié)合大多數(shù)哺乳動物的IgG，但在兩者結(jié)合特異性上有所不同。rProtein A/G免疫磁珠同時共價偶聯(lián)了蛋白A和蛋白G，比單獨的蛋白A或者蛋白G都有更廣的結(jié)合范圍，實用性更高。同時，本品使用的是基因改造后的蛋白A和蛋白G，不僅維持其本身的Ig親和特性，同時也去除了天然蛋白本身的非主要結(jié)合域以降低非特異性結(jié)合。

產(chǎn)品信息

儲存條件

Part Ⅰ-25~-15℃保存；Part Ⅱ2~8℃保存；有效期1年。

Part Ⅱ中的rProtein A/G MagBeads (IP Grade)，避免冷凍。

使用說明

工作液濃度應(yīng)根據(jù)具體實驗確定，建議進行預(yù)實驗摸索最佳實驗濃度。

1. 緩沖液配制

裂解緩沖液：免疫沉淀用(IP)裂解液（36421-A）可解凍后直接使用。

平衡/結(jié)合/洗雜緩沖液：1x TBS Buffer，TBS 緩沖液(粉末)，PH 7.4,1L（36421-G）, 使用時用蒸餾水或超純水溶解，定容至1L即可。

洗脫緩沖液：洗脫緩沖液（36421-H）可直接使用。

中和緩沖液：中和緩沖液（36421-I）可直接使用。

SDS-PAGE Sample Loading Buffer (1X)的配制：取適量SDS-PAGE Sample Loading Buffer (5X)（36421-E）用水稀釋5倍即為SDS-PAGE Sample Loading Buffer (1X)。

2. 抗原樣品制備

本操作說明書提供以下四種樣品處理方法，建議您根據(jù)不同來源的抗原樣品選擇適當(dāng)?shù)姆绞竭M行預(yù)處理，使待檢測抗原釋放至樣品溶液中。

血清樣品處理：若目標蛋白豐度較高， 建議用結(jié)合緩沖液稀釋血清樣品至目標蛋白終濃度為10-100 µg/mL，置于冰上備用(或置于-20℃長期保存)。

懸浮細胞樣品處理：離心收集細胞（4℃, 1000g, 5 min），用手指把細胞用力彈散。按照6孔板每孔細胞加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制劑的裂解液（裂解液應(yīng)在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑Cocktail，使蛋白酶抑制劑Cocktail的最終濃度為1×）。混勻后置于冰上處理10 min；離心收集上清液（4℃, 14000g, 10 min），置于冰上備用（或置于-20℃長期保存）。

貼壁細胞樣品處理：移去培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞兩遍；用細胞刮棒刮脫細胞，收集至1.5mL EP管內(nèi)，按照6孔板每孔加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制劑的裂解液（裂解液應(yīng)在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑Cocktail，使蛋白酶抑制劑Cocktail的最終濃度為1×）。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細胞充分接觸。混勻后置于冰上處理10 min；離心收集上清液（4℃, 14000g, 10 min），置于冰上備用（或置于-20℃長期保存）。

大腸桿菌樣品處理： 離心收集大腸桿菌（4℃, 12000g, 2 min），棄上清后稱重， 按每克（濕重）菌體10 mL的比例用1×PBS洗滌2次；按每克（濕重）菌體5-10 mL的比例加入結(jié)合緩沖液，同時加入蛋白酶抑制劑Cocktail，重懸菌體，超聲裂解細胞，離心收集上清（4℃, 17000g, 10 min）。

3.  磁珠預(yù)處理

1. 將磁珠漩渦振蕩1 min，使其充分混懸；

2. 取25 µL磁珠懸液置于1.5 mL EP管中，放置在磁分離器上，待溶液變澄清后，用移液器吸棄保護液。

3. 加入200 µL結(jié)合緩沖液洗滌，進行磁性分離，吸棄上清，重復(fù)1次。

4.  抗體吸附

1)  加入目標抗體溶液（2-10 µg抗體總量），充分混勻。

2)  室溫孵育 10 min，可以振蕩或漩渦混合均勻。

3)  將EP 管置于磁分離器上，待磁珠全部吸附后，吸棄上清液。如需要可留做進一步檢測。

4)  加入500 μL 洗雜液混合均勻，置于磁分離器上，待磁珠全部吸附后，吸棄上清液。重復(fù)洗雜至少 3次。 

可選做：使用抗體種屬相同的正常IgG配制相同稀釋比或終濃度的正常IgG工作液，以用于去除非特異性結(jié)合或作為陰性對照。所謂種屬相同的正常IgG是指，例如后續(xù)免疫沉淀時用的抗體是小鼠IgG，則在本步驟中可以用TBS稀釋適量的Mouse IgG等以用于降低背景或作為陰性對照。

5.  抗原結(jié)合反應(yīng)

1)  加入含有抗原的樣品（通常300-500 μL，每個免疫沉淀反應(yīng)推薦的總蛋白量為 500 ~1500 μg)，用移液器輕輕吹打使抗原與磁珠-抗體復(fù)合物均勻分散。

2)  在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀或者手工輕輕翻轉(zhuǎn)離心管 10 min，使抗原與抗體充分結(jié)合，如結(jié)合力較弱則可在室溫下反應(yīng)1h或者在4℃下反應(yīng)過夜。

3)  上述完成抗原吸附的磁珠-抗體-抗原復(fù)合物進行磁性分離，收集上清液，以備后續(xù)檢測。

4)  向離心管中加入1 mL洗雜液，用移液器輕輕吹打使磁珠-抗體-抗原復(fù)合物均勻分散，然后進行磁性分離，棄上清液；從磁分離器上取下離心管，再重復(fù)洗滌兩次。

6．抗原洗脫

A. 變性洗脫 此方法洗脫的樣品適用于SDS-PAGE檢測。

1) 從磁分離器上取下離心管，向其中加入80~100 μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer 混合均勻， 95℃加熱 5min。

2) 置于磁性分離器上，進行磁性分離，收集上清液進行SDS-PAGE檢測。

B. 非變性洗脫

1) 向磁珠-抗體-抗原復(fù)合物中加入100 μL洗脫液，混合均勻，室溫孵育10 min。

2) 置于磁性分離器上，進行磁性分離，收集洗脫液至新的 EP 管中。

3) 重復(fù)步驟 1）和2），收集洗脫液，與2）中洗脫液混合，加入中和液中和至 pH7.0-8.0。

注意事項

1. 請勿高速離心、干燥或冷凍磁珠，這些操作會導(dǎo)致磁珠聚集而降低結(jié)合能力。

2. 本試劑盒提供的Lysis Buffer for IP Assays經(jīng)反復(fù)測試，適合很多情況下的免疫沉淀或免疫共沉淀時的樣品裂解和后續(xù)的洗滌。但 IP 實驗中不同類型的抗體與抗原結(jié)合的親和性是有區(qū)別的，抗體與抗原結(jié)合還會受到 Lysis/Wash Buffer 的影響，因此可自行優(yōu)化操作細節(jié)或者篩選及配制緩沖液進行實驗。

3. 本產(chǎn)品僅作科研用途。

4. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。