TMD8人彌漫大B細胞淋巴瘤細胞

TMD8人彌漫大B細胞淋巴瘤細胞

生長狀態(tài):貼壁
細胞培養(yǎng)步驟
一.培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備:
1) 準備培養(yǎng)基;北美胎牛血清,10%;雙抗1%。
2) 培養(yǎng)條件: 氣相:空氣,95%;二氧化碳,5%。 溫度:37攝氏度,培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。 3) 凍存液:90%血清,10%DMSO,現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲存。
二.細胞處理:
1) 復蘇細胞:將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘,棄去上清液,補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜(或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0cm皿中,加入約8ml培養(yǎng)基,培養(yǎng)過夜)。第二天換液并檢查細胞密度。
2) 細胞傳代:如果細胞密度達80%-90%,即可進行傳代培養(yǎng)。 對于貼壁細胞,傳代可參考以下方法: 棄去培養(yǎng)上清,用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
1. 加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養(yǎng)瓶中,置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘,然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,若細胞大部分變圓并脫落,迅速拿回操作臺,輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
2. 按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基,輕輕打勻后吸出,在1000RPM條件下離心4分鐘,棄去上清液,補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
3. 將細胞懸液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。 細胞凍存:待細胞生長狀態(tài)良好時,可進行細胞凍存。 下面T25瓶為例;
1.細胞凍存時,棄去培養(yǎng)基后,PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶,細胞變圓脫落后,加入2mlwan全培養(yǎng)基終止消化,可使用血球計數(shù)板計數(shù)。
2.1000RPM離心5分鐘去掉上清。用血清重懸浮,加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻,按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中,注意凍存管做好標識。本公司按每個凍存管細胞數(shù)目大于1X106個細胞凍存。
3.將凍存管置于程序降溫盒中,放入-80度冰箱,至少2個小時以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
注意事項:
1. 收到細胞后首先觀察細胞瓶是否完好,培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象,若有上述現(xiàn)象發(fā)生請及時和我們聯(lián)系。
2. 先不開瓶蓋,瓶身擦拭酒精后放在培養(yǎng)箱靜置數(shù)小時(4h左右),穩(wěn)定細胞狀態(tài),切忌在溫箱內(nèi)靜置過夜。
3. 靜置后鏡檢,拍照,記錄細胞狀態(tài)。建議傳代后也拍照記錄細胞生長情況。
4. 貼壁細胞:若細胞密度超過80%,可正常傳代;若未超過80%,收集細胞瓶內(nèi)的培養(yǎng)基,留8ml繼續(xù)培養(yǎng)至80%左右再傳代,瓶蓋可稍微擰松。
5. 細胞瓶內(nèi)的培養(yǎng)基含血清和雙抗,可收集后4℃保存?zhèn)溆?可補加2%血清。剛開始傳代時建議一半用細胞瓶內(nèi)的培養(yǎng)基,一半用客戶自備的培養(yǎng)基,使細胞逐漸適應培養(yǎng)條件,以免因不適應而造成生長狀態(tài)不佳。
6. 細胞胰酶消化液建議使用PBS配制,
7. 因為細胞培養(yǎng)過程外因太多,所以我們的售后保障期為一周,超過一周的細胞我們會酌情處理,但不提供免費更換服務。 T細胞運輸和保存:可選擇干冰運輸及發(fā)送復蘇存活細胞方式:(1)干冰運輸,收到后立即轉(zhuǎn)入液氮凍存或直接復蘇;存活細胞,收到后應繼續(xù)生長,傳代達到細胞生長狀態(tài)良好時,再進行凍存。具體操作見細胞培養(yǎng)步驟。