磷酸烯醇式丙tong酸羧化酶（PEPC)試劑盒說(shuō)明書

分光光度法 50 管/48 樣

磷酸烯醇式丙tong酸羧化酶試劑盒 糖酵解

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

PEPC（EC 4.1.1.31）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和細(xì)胞中，是催化磷酸烯醇式丙tong酸與二氧化碳反應(yīng)生成草xian乙酸呈不可逆反應(yīng)的酶，對(duì)三羧酸循環(huán)的運(yùn)轉(zhuǎn)起重要調(diào)節(jié)作用。

測(cè)定原理：

PEPC 催化磷酸烯醇式丙tong酸和CO2 生成草xian乙酸和HPO4^2-，蘋果suan脫氫酶進(jìn)一步催化草xian乙酸和 NADH 生成蘋果酸和NAD⁺，在 340nm 測(cè)定NADH 減少速率，計(jì)算PEPC 活性。

組成：

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 ml 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

3、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑五工作液的配制：將試劑五原液：試劑五稀釋液=1μl:329μl 稀釋，用多少配多少。

3、將試劑一、二、三、四和試劑五工作液置于 37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其它物種)預(yù)熱 5 分鐘。加樣表：

將上述試劑按順序加入 1 ml 石英比色皿中，立即混勻，加樣本的同時(shí)開始計(jì)時(shí)，340 nm 波長(zhǎng)下記錄初始吸光度A1 和反應(yīng) 5 分鐘后的吸光度A2。計(jì)算ΔA=A1-A2。

注意事項(xiàng)：如果一次性測(cè)定樣本數(shù)較多，可將試劑一、二、三、四、和試劑五工作液按比例配成混合液。

PEPC 活性計(jì)算：

1、血清（漿）PEPC 活力計(jì)算

單位定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PEPC（nmol/min/ml））＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷V 樣÷T=1624×ΔA 2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 PEPC 活力計(jì)算

按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg 組織蛋白每分鐘消耗 1nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PEPC（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1624×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g 組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PEPC（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T=1624×ΔA÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PEPC（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=3.248×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1.010×10-3 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.02 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。

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