丙tong酸激酶（Pyruvate kinase，PK）試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

丙tong酸激酶試劑盒 糖酵解

正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

PK（EC 2.7.1.40）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，催化糖酵解過程中的最后一步反應(yīng)，是糖酵解過程中的主要限速酶之一，也是產(chǎn)生ATP 的關(guān)鍵酶之一，因此測定PK 活性具有重要意義。

測定原理：

PK 催化磷酸烯醇式丙tong酸和ADP 生成ATP 和丙tong酸，乳酸脫氫酶進(jìn)一步催化NADH 和丙tong酸生成乳酸和NAD⁺，在 340nm 下測定NADH 下降速率，即可反映 PK 活性。

組成：

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水

樣本的前處理：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

試劑二的配制：臨用前取試劑二一瓶，加入 9ml 試劑一和 1.06ml 蒸餾水充分溶解，置于 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 5min；現(xiàn)配現(xiàn)用。

試劑三的配制：臨用前取試劑三一支，加入 0.6ml 蒸餾水充分溶解待用；現(xiàn)配現(xiàn)用。

在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 樣本、10μl 試劑三和 180μl 試劑二，混勻，立即記錄 340nm處 20s 時(shí)的吸光值A(chǔ)1 和 2min20s 后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A1-A2。

PK 活性計(jì)算：

用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下：

1、血清（漿）中 PK 活力的計(jì)算:

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PK（nmol/min/ml）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷V 樣÷T=1608×ΔA 2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 PK 活力的計(jì)算:

按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PK（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T=1608×ΔA÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PK（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=3.216×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，2min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。

用 96 孔板測定的計(jì)算公式如下：

1、血清（漿）中 PK 活力的計(jì)算:

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PK（nmol/min /ml）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷V 樣÷T=3216×ΔA 2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 PK 活力的計(jì)算:

按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PK（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T=3216×ΔA÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PK（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=6.432×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板光徑，0.5cm； V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，2min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。

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