乙酸激酶（acetate kinase，ACK）試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

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正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

ACK 主要存在于微生物中，催化乙酸和ATP 生成乙酰磷酸和 ADP，是細(xì)菌碳代謝和能量代謝的關(guān)鍵酶，尤其是在古細(xì)菌甲烷合成代謝中起著中樞作用。

測定原理：

（1）ACK 催化乙酸鈉和ATP 生成乙酰磷酸和ADP，（2）丙tong酸激酶催化 ADP 和PEP 生成ATP 和丙酮酸，（3）乳酸t(yī)uo氫酶催化丙酮酸和 NADH 生成乳酸和NAD⁺，（4）在 340nm 下測定NADH 氧化生成NAD⁺速率，即可反映ACK 活性。

試劑組成和配制：

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水

樣本的前處理：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：

先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

工作液的配置：臨用前取試劑二一瓶，加入 10ml 試劑一和 200μl 試劑三，充分混合溶解，置于37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 5min；現(xiàn)配現(xiàn)用；

在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 20μl 樣本和 180μl 工作液，混勻，立即記錄 340nm 處 20s

時的吸光值A(chǔ)1 和 3min20s。

ACK 活性計算：

用微量石英比色皿測定的計算公式如下：

按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。

ACK（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=536×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。

ACK（nmol/min /g 鮮重）= [ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=536×ΔA÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。

ACK（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=1.072×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.02 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時間，3 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。

用 96 孔板測定的計算公式如下

按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。

ACK（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1072×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。

ACK（nmol/min /g 鮮重）= [ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=1072×ΔA÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。

ACK（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)      ÷T=2.144×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.02 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時間，3 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。

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