錳過氧化物酶（Manganese peroxidase，Mnp）試劑盒說明書

微量法 100T/96S

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正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

錳過氧化物酶（EC1.11.1.13）是一種含亞鐵血紅素的過氧化物酶，主要存在于擔(dān)子菌中，屬于木質(zhì)素降解酶系，能有效的降解木質(zhì)素及廢水和土壤中比較難降解的氯化物，疊dan化合物、DTT，多環(huán)芳烴等。

測(cè)定原理：

錳過氧化物酶在 Mn2+存在的條件下，將愈創(chuàng)木酚氧化為四鄰甲氧基連酚，在 465nm 有特征吸收峰。

試劑組成和配制：

需自備儀器和用品：

天平、研缽、低溫離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、恒溫水浴鍋。

酶液提?。?/span>

1、組織：按照質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g，加入 1ml 試劑一）加入試劑一，冰浴勻漿后于 4℃，10000g 離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

2、細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：試劑一體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入1ml 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 4℃，10000g離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3、培養(yǎng)液或其它液體：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 465nm，蒸餾水調(diào)零。

2、測(cè)定前將試劑一、二、三、四在 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）放置 10min 以上。

在微量石英比色皿或 96 孔板中按順序加入上述試劑，立即混勻并計(jì)時(shí)，記錄 465nm 下 30s 時(shí)的吸光值A1 和 2min30s 后的吸光值 A2。計(jì)算ΔA＝A2-A1。

注意事項(xiàng)

若一次性測(cè)定樣本較多，可將試劑一、二、三、四按比例配成混合液，在 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃

（其它物種）放置 10min 以上，測(cè)定時(shí)加入 20µl 樣本和 180µl 混合液測(cè)定。

酶活計(jì)算公式：

用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol 愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。 MnP 活性（nmol/min/mg prot）= [ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=413×ΔA÷Cpr 2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：每克樣品每分鐘氧化 1nmol 愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

MnP 活性（nmol/min/g 鮮重）= [ΔA×V 反總÷（ε×d）×109] ÷（V 樣×W÷V 樣總）÷T= 413×ΔA÷W 3．按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：每 104 個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化 1nmol 愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

MnP 活性（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109] ÷（V 樣×細(xì)胞數(shù)量÷V 樣總）÷T

= 413×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量 4．按照液體體積計(jì)算

酶活性定義：每毫升培養(yǎng)液每分鐘氧化 1nmol 愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

MnP 活性（nmol/min/ml）= [ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷V 樣÷T= 413×ΔA

ε：愈創(chuàng)木酚摩爾消光系數(shù)：12100L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 反總：反應(yīng)總體積，2×10-4 L； V 樣：反應(yīng)中樣本體積，0.02ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，2min

用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol 愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。 MnP 活性（nmol/min/mg prot）= [ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=826×ΔA÷Cpr 2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：每克樣品每分鐘氧化 1nmol 愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

MnP 活性（nmol/min/g 鮮重）= [ΔA×V 反總÷（ε×d）×109] ÷（V 樣×W÷V 樣總）÷T= 826×ΔA÷W 3．按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：每 104 個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化 1nmol 愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

MnP 活性（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109] ÷（V 樣×細(xì)胞數(shù)量÷V 樣總）÷T

= 826×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量 4．按照液體體積計(jì)算

酶活性定義：每毫升培養(yǎng)液每分鐘氧化 1nmol 愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

MnP 活性（nmol/min/ml）= [ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷V 樣÷T= 826×ΔA

ε：愈創(chuàng)木酚摩爾消光系數(shù)：12100L/mol/cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；V 反總：反應(yīng)總體積，2×10-4 L；V 樣：反應(yīng)中樣本體積，0.02ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，2min。

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