肉桂醇脫氫酶（ Cinnamyl-alcohol dehydrogenase，CAD)試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

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正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

CAD 是木質(zhì)素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一，是木質(zhì)素單體合成反應(yīng)中的最后一步，催化多種不同的肉桂醛（香豆醛、芥子醛以及松柏醛等）生成與之相應(yīng)的肉桂醇。該酶多存在于高等植物、酵母、菌類中，研究該酶可以探討多種生物細(xì)胞發(fā)育過程中木質(zhì)素沉積的代謝機(jī)理，為減少水果石細(xì)胞含量提高其品質(zhì)提供依據(jù)。

測定原理：

CAD 催化肉桂醇和NADP 生成肉桂醛和NADPH，在 340nm 下測定NADPH 生成速率，即可反映 CAD活性。

試劑的組成和配制：

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提取：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：

先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

在試劑二中加入 10ml 試劑一充分溶解混勻，室溫使用渦旋振蕩儀振蕩溶解 15min，如未溶解可適當(dāng)延長振蕩時(shí)間；置于 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 5min；現(xiàn)配現(xiàn)用（配好后 24h 內(nèi)用完）；

在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 樣本和 190μl 試劑二，混勻，立即記錄 340nm 處初始吸光值A1 和 5min 后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

CAD 活性計(jì)算：

a、用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下：

按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 的NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

CAD（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g 組織每分鐘產(chǎn)生 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

CAD（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=643×ΔA÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

CAD（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=1.286×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。

b、用 96 孔板測定的計(jì)算公式如下:

1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 的NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

CAD（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g 組織每分鐘產(chǎn)生 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

CAD（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=1286×ΔA÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

CAD（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=2.572×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。

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