堿性蛋白酶（Alkaline protease, AKP）活性測定試劑盒說明書

分光光度法 50 管/24 樣

堿性蛋白酶活性測定試劑盒

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

AKP 是指在堿性條件下催化蛋白質肽鍵水解的酶類，屬于絲an酸蛋白酶。此外，該酶還能夠水解酯鍵、酰胺鍵，具有轉酯及轉肽的功能。該酶是主要工業(yè)用酶之一，廣泛應用于制藥、絲綢、食品、制革等行業(yè)。

測定原理：

在堿性條件下，AKP 水解酪蛋白生成酪an酸；在堿性條件下，酪an酸還原磷鉬酸生成鎢藍；鎢藍在680nm 有特征吸收峰，測定 680nm 吸光度增加速率，來計算AKP 活性。

組成：

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加 10 ml 蒸餾水溶解。

試劑三：粉劑×1 瓶，4℃避光保存。臨用前加入 20 ml 試劑一，沸水浴中磁力攪拌溶解。（可在燒杯上蓋一層保鮮膜，注意觀察，避免水分全部蒸發(fā)，一般加熱 15-30 分鐘，該試劑為過飽和試劑，充分混勻后仍出現顆粒物不溶物不影響使用）。

試劑四：粉劑×1 瓶， 4℃保存。臨用前加 50 ml 蒸餾水溶解。

標準品：液體 1ml×1 支，0.25 μ mol/ml 標準酪an酸溶液，4℃保存。

自備儀器和用品：

可見分光光度計、水浴鍋、磁力攪拌器、可調式移液槍、1.5 ml EP 管、1ml 玻璃比色皿和蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）冰浴勻漿，8000g，4℃離心 10min，取上清，即粗酶液。

血清或培養(yǎng)液：直接測定。

細菌、真菌：按照細胞數量（10⁴ 個）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；然后 8000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測。

測定操作：

分光光度計預熱 30min，調節(jié)波長到 680 nm，蒸餾水調零。

試劑二、試劑三和試劑四置于 40℃水浴保溫 30min。

對照管：取一支EP 管，加入 100μL 粗酶液（血清或培養(yǎng)液），200μL 試劑二，混勻后置于 40℃水浴保溫 10min；加入 200μL 試劑三，混勻后 8000g ，4℃離心 10min；取 200μL 上清液，加入新的EP 管，再加

入 1000μL 試劑四，200μL 試劑五，混勻后置于 40℃水浴保溫 20min，于 680nm 測定光吸收，記為A 對照管。

測定管：取一支EP 管，加入 100μL 粗酶液（血清或培養(yǎng)液），200μL 試劑三，混勻后置于 40℃水浴保溫 10min；加入 200μL 試劑二，混勻后 8000g ，4℃離心 10min；取 200μL 上清液，加入新的EP 管，再加

入 1000μL 試劑四，200μL 試劑五，混勻后置于 40℃水浴保溫 20min，于 680nm 測定光吸收，記為A 測定管。（注意與對照管不同，先加試劑三，后加試劑二）

空白管：取一支EP 管，加入 200μL 蒸餾水，1000μL 試劑四 200μL 試劑五，混勻后置于 40℃水浴保溫

20min，于 680nm 測定光吸收，記為 A 空白管。

標準管：取 EP 管，加入 200μL 標準品，1000μL 試劑四，200μL 試劑五，混勻后置于 40℃水浴保溫 20min，于 680nm 測定光吸收，記為A 標準管。

注意：空白管和標準管只需要測定一次。計算公式：

按照樣本蛋白濃度計算

AKP 活性單位定義：30℃每毫克蛋白每分鐘水解產生 1nmol 酪an酸為 1 個酶活單位。

AKP 活性（nmol/min /mg prot）= C 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）×V 反總

÷(Cpr×V1)÷T= 125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）÷Cpr 2．按照樣本質量計算

AKP 活性單位定義：30℃每克樣品每分鐘催化水解產生 1 nmol 酪an酸為 1 個酶活單位。

AKP 活性（nmol/min /g 鮮重）=C 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）×V 反總÷

（W×V1÷V2）÷T= 125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）÷W

3. 按照液體體積計算

AKP 活性單位定義：30℃每毫升樣品每分鐘催化水解產生 1nmol 酪an酸為 1 個酶活單位。

AKP 活性（nmol/min/ml）=C 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）×V 反總÷V1÷T= 125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）

1.  按照細胞數量計算

AKP 活性單位定義：30℃每 10⁴ 個細胞每分鐘催化水解產生 1nmol 酪an酸為 1 個酶活單位。

AKP 活性（nmol/min /10⁴ cell）=C 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）×V 反總÷（細胞數量×V1÷V2）÷T= 125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）÷細胞數量

C 標準品：0.25 μ mol/ml 標準酪an酸溶液；V 反總：酶促反應總體積，0.5ml；Cpr：粗酶液蛋白質濃度（mg/ml）； V1：加入反應體系中粗酶液體積（ml），0.1 ml；V2：提取液總體積（ml），1ml；T：催化反應時間（min）， 10min；W：樣品質量（g）。

注意事項：

臨用前配制的試劑配置好后 3 天內使用完畢。

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