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產(chǎn)品簡介：

致突變 PCR（error-prone PCR）是利用天然 Taq DNA 多聚酶不具有 3′→5′ 校對功能的特性，在一定條件下（如不同的 dNTP 濃度、Mg 濃度和 MnCl2 存在）能夠按較高的機(jī)率引入隨機(jī)引入突變而設(shè)計(jì)。如果有適當(dāng)?shù)耐蛔冞x擇方法，則可從構(gòu)建的突變庫選出所需突變體，用于人工誘變。本產(chǎn)品就是根據(jù)此原理開發(fā)得產(chǎn)品。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.即開即用，十分簡單方便，尤其在生物制藥和酶學(xué)研究領(lǐng)域顯示出了它的優(yōu)-越性。

2.配方經(jīng)過精心優(yōu)化，突變率穩(wěn)定，突變沒有趨向性。致突變 PCR 的突變率為 0.66%

（±0.13%），詳見使用手冊疑難解答。

3.比體內(nèi)基因突變更快捷簡單，但如果在 PCR 引物中設(shè)計(jì)位點(diǎn)，則可使產(chǎn)物克隆到表達(dá)載體，也可以用于體內(nèi)蛋白活性的篩選。

4.可用于連續(xù)致突變 PCR（sequential error-prone PCR），只需把上一次致突變 PCR 的產(chǎn)物用作下一次致突變 PCR 的模板即可，使每一次獲得的小突變累積而產(chǎn)生重要的有益突變。

5.只適用于擴(kuò)增 1kb 以下的產(chǎn)物，對于 1kb 以上的產(chǎn)物，建議分段擴(kuò)增。

6.本產(chǎn)品足夠 100 次 30uL 體系的易錯(cuò) PCR 反應(yīng)。

7.致突變PCR試劑盒只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

成份規(guī)格包裝

10×致突變 PCR Mix（含酶）300 uL0.5mL 紅色蓋

致突變 PCR 專用 dNTP300 uL0.5mL 黃色蓋

致突變 PCR 增強(qiáng)劑300 uL0.5mL 白色蓋

追加 dNTP，0.5mM300 uL0.5mL 本色管

致突變 PCR 專用 MnCl2300 uL0.5mL 綠色蓋

使用手冊1 份無

保存和運(yùn)輸

低溫運(yùn)輸，-20℃保存, 有效期為一年。

自備試劑

引物、DNA 模板、超純水。

使用方法：

1.將自備的 PCR 引物稀釋到 10uM。引物是決定致突變 PCR 成敗的關(guān)鍵因素，設(shè)計(jì)引物時(shí)要保證其 Tm 在 70℃，長度在 25-30nt 之間，GC 含量在 45%-60%之間，3 端 GC 含量低，并且沒有發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

2.用自備引物和自備的常規(guī)PCR 試劑擴(kuò)增制備致突變DNA 模板（常規(guī) PCR 產(chǎn)物），

膠回收并準(zhǔn)確確定濃度。注意：致突變 PCR 的模板一定要用膠回收的常規(guī) PCR 產(chǎn)物，因?yàn)槟z回收可以把電泳不可見的非特異性擴(kuò)增片段去除，否則這些片段由  于也是用致突變 PCR 引物擴(kuò)增所得，在致突變 PCR 擴(kuò)增時(shí)也會被擴(kuò)增，產(chǎn)生競爭抑制，降低靶分子的擴(kuò)增效率。如果致突變 PCR 制備模板的引物和致突變 PCR 引物不同（類似巢式 PCR）則可以避免此問題，但需要合成兩對引物。本試劑盒只適用于擴(kuò)增 1kb 以下的產(chǎn)物，對于 1kb 以上的產(chǎn)物，建議分段擴(kuò)增。

3.將回收的 DNA 片段（模板）用水稀釋到 1ng/uL 、10ng/uL 和 100ng/uL 三個(gè)濃度。注意：模板使用量是影響突變率的最重要因素，因?yàn)槟０?DNA 為非突變 DNA，擴(kuò)增產(chǎn)生的 DNA 為突變 DNA，致突變 PCR 體系跟常規(guī) PCR 一樣， 最后會達(dá)到擴(kuò)增平臺，最終得到的擴(kuò)增 DNA 的量是固定的，因此起始模板 DNA 使用量越大，則突變 DNA 在最終得到的總 DNA 中的相對比例就越低。但模板太少又不容易擴(kuò)增成功，所以建議同時(shí)測試三個(gè)模板用量。如果都成功，則優(yōu)先選  用模板濃度低的 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行分析。

4.設(shè)置 30uL 體系的致突變 PCR 反應(yīng)。在一干凈的 PCR 管中，加入下列成分。由于 Mn 離子容易跟其他成分發(fā)生沉淀反應(yīng)，因此上機(jī)前最后加 MnCl2：

5.立即按下列參數(shù)進(jìn)行易錯(cuò) PCR：

步驟參數(shù)循環(huán)數(shù)

PCR 前變性94℃ 3 分鐘循環(huán) 1 次

致突變 PCR94℃ 1 分鐘

循環(huán) 30-60 次

60℃ 1 分鐘

72℃ 3-10 分鐘

注：由于致突變 PCR 含高濃度的鎂離子，因此引物容易互為模板形成引物二聚體，因此使用 60℃為復(fù)性溫度。在錯(cuò)誤堿基摻入后，DNA 合成會暫時(shí)停滯，因此為了讓 DNA 合成繼續(xù)，需要延長合成的時(shí)間到 3-10 分鐘。致突變 PCR 循環(huán)次數(shù)越多，突變 DNA（擴(kuò)增產(chǎn)物）與非突變 DNA（原始模板）的比例就越高。此外在突變率和模板長度恒定的情況下，擴(kuò)增次數(shù)越多，發(fā)生突變的絕對數(shù)就越  高，在同一模板上發(fā)生的突變位點(diǎn)數(shù)就越多，所以如果需要，可以做 30、35、40、45、50、55、60 次 7 個(gè)循環(huán)數(shù)的比較。

6.致突變 PCR 結(jié)束后，各取 3uL 進(jìn)行電泳檢查。

7.如果有預(yù)期大小的 PCR 產(chǎn)物，則全部電泳，進(jìn)行膠回收，再進(jìn)行克隆和測序等后續(xù)操作。如果需要增加突變率，可以選擇一個(gè)突變后的 DNA 為模板，再進(jìn)行下一輪致突變 PCR。

8.如果沒有 PCR 產(chǎn)物，則按下列操作進(jìn)行追加 PCR。

9.在致突變 PCR 管中，加入 3uL 追加 dNTP 到 27uL 剩下的致突變 PCR 體系中， 按下表進(jìn)行追加 PCR（chasing PCR）。

10.追加 PCR 結(jié)束后，再電泳檢測。如果有條帶，再進(jìn)行克隆和測序等后續(xù)操作。如果需要增加突變率，可以選擇一個(gè)突變后的 DNA 為模板，再進(jìn)行下一輪致突變 PCR。

11.如果沒有預(yù)期大小的 PCR 產(chǎn)物，則需要分析原因。

選擇我們的致突變PCR試劑盒，就是選擇精準(zhǔn)、高效、可靠的檢測方案，為您的科研實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航！