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產(chǎn)品簡介：

用 PCR 對 DNA 進行生物-素標記的原理是用帶生物-素標記的 dNTP 進行PCR 擴增，這些 dNTP 摻入到PCR 產(chǎn)物中之后，擴增得到的 DNA 片段自然就帶有生物-素標記，可以直接用于雜交試驗。本產(chǎn)品就是基于上述原理開發(fā)的。

產(chǎn)品特點：

1.一站式，本試劑盒經(jīng)過精心優(yōu)化，不需要用戶自己摸索標記條件。

2.優(yōu)化的生物-素摻入率，能有效降低探針中生物-素分子之間的可能空間阻礙，檢測效果佳。

3.得到的生物-素標記DNA 探針可以用于 Southern 雜交、Northern 雜交、原位雜交、菌落雜交和斑點印跡雜交等分析。

4.既可用于制備雙鏈DNA 探針，也可以用于制備單鏈 DNA 探針。

5.一次標記反應(yīng)可以得到μg 級的生物-素標記雙鏈 DNA 探針或約 700 ng

生物-素標記單鏈DNA 探針，足夠多次雜交實驗用。

6.本產(chǎn)品足夠 5 次生物-素標記 PCR 反應(yīng)（50 μL 體系）。

7.DNA 探針生物-素標記試劑盒（PCR 法）只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

成份規(guī)格包裝

標記專用PCR Mix(含酶)30 μL0.5 mL 紅蓋管

dNTP Mix，2.5 mM each25 μL0.5 mL 白蓋管

含 Biotin-11-dUTP 的

dNTP，2.5 mM each25 μL0.5 mL 綠蓋管

超純水1 mL1.5 mL 藍蓋管

使用手冊1 份無

保存和運輸

低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

自備試劑

無

使用方法：

DNA 模板和模板專一性引物，常規(guī) PCR 反應(yīng)所需試劑，瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒。

一：準備工作

1.按常規(guī)的方法設(shè)計PCR 引物，使 PCR 產(chǎn)物（探針）長度在 400-800 bp

之間。過短則生物-素標記摻入少，探針雜交信號強度減弱；過長則非特異雜交增加，背景變強。

2.為保證成功率，最好先用常規(guī) PCR 產(chǎn)物制備 DNA 片段，再以之為模板進行標記PCR 反應(yīng)。不推薦以基因組 DNA 或其他背景復(fù)雜的 DNA 為模板直接進行 PCR 標記反應(yīng)。

二：用常規(guī)PCR 制備模板

3.用自備的 PCR 試劑盒按下表配置 50 μL 的常規(guī) PCR 反應(yīng)以制備標記

PCR 模板：

成份加入量

自備的 2×PCR Mix（含酶，含 dNTP）25 μL引物一和引物二（10 pmol/μL）各 5 μL

1 μg 基因組 DNA 或 1 ng 質(zhì)粒 DNA1 μL

超純水補到 50 μL

4.按引物 Tm 值設(shè)計的PCR 參數(shù)進行常規(guī)PCR。

5.用自備膠回收試劑盒回收常規(guī)PCR 產(chǎn)物并定量。膠回收步驟可以去殘留引物，避免這些引物干擾后續(xù)的標記 PCR 反應(yīng)。

三：標記 PCR 反應(yīng)

注意：由于雙鏈PCR 探針在雜交時變性的雙鏈彼此還會復(fù)性，降低雜交效率，因此強烈推薦使用單鏈標記 PCR。在設(shè)置標記 PCR 時必須做一個

常規(guī)PCR 對照（本試劑盒足夠 5 次標記 PCR 實驗）。

成份標記PCR常規(guī)PCR（自備）

標記專用PCR Mix（含酶）6 μL6 μL

含 Biotin-11-dUTP 的

dNTP，2.5 mM each5 μL不加

dNTP Mix，2.5 mM each不加5 μL

若雙鏈標記，加引物一和引物二；

若單鏈標記，只加一條引物

各 50 pmol

各 50 pmol

膠回收所得 PCR 產(chǎn)物10 ng（對雙鏈標記）

100 ng（對單鏈標記）10 ng（對雙鏈標記）

100 ng（對單鏈標記）

超純水補到 50 μL補到 50 μL

6.由于此步所用的 PCR 引物和第 3 步的 PCR 引物完-全一樣，故可以參考第 3 步PCR 參數(shù)進行標記 PCR，但需要進行下列修改：一是循環(huán)數(shù)增加到 35-55 個循環(huán)，使擴增得到的探針 DNA 片段參差不齊，雜交時這種DNA 能形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，雜交效果比長度整齊的 DNA 更好；二是延伸步驟的時間增加 15 秒，因為標記 dUTP 摻入到DNA 的速度比常規(guī)的 dTTP 慢，增加延伸步驟的時間可以保證更多的標記 dUTP 摻入到合成的DNA 探針中；三是降低復(fù)性溫度 5-7℃，因為標記核苷酸摻入到 DNA 后，含標記核苷酸的 DNA 的 Tm 值將比正常的DNA 低。

7.PCR 結(jié)束后，取標記 PCR 反應(yīng)液和對照反應(yīng)液 3-5 μL 進行瓊脂糖凝膠

電泳（一定要使用濃度已知的 DNA marker），檢測標記是否成功。由

于標記 DNA 含有額外的標記物、分子量更大，其泳動速度將慢于常規(guī)PCR 產(chǎn)物。下圖是一個典型的雙鏈標記 PCR 產(chǎn)物和常規(guī) PCR 產(chǎn)物電泳速度差異的比較圖：

標記的 DNA（右）與未標記的 DNA（左）電泳比較

8.探針的定量：電泳所用的DNA marker 濃度已知（如果不確定，可以問供應(yīng)商），上樣體積已知，故上樣量已知，就可通過雙鏈探針 DNA 和DNA marker 對應(yīng)條帶的相對亮度來估計探針 DNA 濃度。例如，如果探針長度為 500 bp，而 marker 中 500 bp 這條帶的濃度是 10 ng/μL，共上樣 10 μL，則 500 bp 這條帶的上樣量為 100 ng。標記的探針 DNA在紫外下亮度只有它的一半，則探針 DNA 的上樣量為 100/2=50 ng， 如果上樣量是 5 μL，則探針的濃度是 50/5=10 ng/μL。但是，如果制備的是單鏈 DNA 探針，則不能按此法估計濃度，因為單鏈 DNA 結(jié)合核酸染料（如 EB 和 SYBR GreenI）的能力遠低于雙鏈 DNA。但可采用銀染法定量（跟marker 比較）。一般 100 ng 模板經(jīng)單鏈標記 PCR 擴增可得到 700 ng 左右的單鏈探針。

9.單鏈 PCR 標記產(chǎn)物可不經(jīng)純化直接加到雜交液中，雙鏈 PCR 標記產(chǎn)物需加熱到 95-100℃ 5 分鐘變性然后放冰上急冷后再加到雜交液中使用。

10.如果探針不立即使用，需要放-20℃長期保存，不能放常溫保存，否則 Taq DNA 酶的殘留的外切酶活性會降解探針 DNA。如果需要純化探針 DNA，請使用本公司的核酸探針純化試劑盒（排阻層析法）。

選擇我們的DNA 探針生物-素標記試劑盒（PCR 法），就是選擇精準、高效、可靠的檢測方案，為您的科研實驗保駕護航！