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產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

植物線粒體是重要的植物細(xì)胞器，負(fù)責(zé)植物細(xì)胞 ATP 的產(chǎn)生。此外，植物很多重要的特性(如雄性不育)也跟線粒體相關(guān)，是母系遺傳研究的重要材料，因此常常需要進(jìn)行線  粒體 DNA 純化。本產(chǎn)品就是專門(mén)用于植物細(xì)胞線粒體 DNA 純化的試劑盒。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.即用型試劑盒，用戶不需要單獨(dú)配制各種溶液或優(yōu)化操作流程。

2.提供粗提和精提兩種操作方案。粗提只需常規(guī)臺(tái)式冷凍離心機(jī)，利用差速分離原理進(jìn)  行線粒體粗提，所得線粒體雖然含少量其他細(xì)胞器污染，但可用于后續(xù)的 PCR 級(jí)別的線粒體 DNA 提取。

3.精提需要冷凍超速離心（離心力達(dá) 40000×g），利用密度梯度來(lái)將粗提制備的線粒體和其他細(xì)胞成分進(jìn)一步分開(kāi)，得到線粒體精提液，適用于后續(xù)的測(cè)序級(jí)別的線粒體 DNA 提取。

4.本產(chǎn)品足夠 5 次提取，每次可處理 10 g 綠色植物組織（可得 1-2.5 mg 左右線粒體） 或 20 g 非綠色植物組織（可得 2-5 mg 左右的線粒體）。

5.植物線粒體DNA純化試劑盒只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

本試劑第一部分包裝為大紙盒，常溫運(yùn)輸和保存。

成 分 規(guī)格包裝

植物線粒體提取勻漿液250 mL250 mL 本色瓶

植物線粒體提取洗滌液250 mL×2250 mL 本色瓶

植物線粒體提取離心介質(zhì)150 mL250 mL 本色瓶

帶柄尼龍篩1 個(gè)自有包裝

軟毛筆1 只無(wú)包裝

Percoll50 mL60 mL 本色瓶

詹納斯綠 B 染色液（0.2%）1 mL1.5 mL 棕色管

細(xì)胞器 DNA 純化溶液 A3 mL5 mL 本色瓶

細(xì)胞器 DNA 純化溶液 B0.75 mL1.5 mL 白蓋管

使用手冊(cè)1 份無(wú)

成 分 規(guī)格包裝

BSA 干粉10 g30 mL 本色瓶

DNase A 干粉1 mg1.5 mL 藍(lán)蓋管

保存和運(yùn)輸

常溫運(yùn)輸和保存, 保存期限一年。

自備試劑

超純水、5 M KOH（調(diào) pH 用），25 mM MgCl2 溶液、0.5 M EDTA 溶液、氯仿、異丙醇、75%乙醇、TE 緩沖液。

使用方法：

注意：線粒體膜對(duì)溫度高度敏感，所以整個(gè)操作必須在冰上或者在冷室進(jìn)行，所用植物組

織，器皿和溶液均需要在 4℃預(yù)冷。任何情況下線粒體的溫度都不要超過(guò) 4℃。

線粒體粗提操作流程：

1.將 10 g 的綠色植物組織（去葉脈后的嫩葉子、愈傷組織）或 20 g 干凈的非綠色植物組織（如發(fā)芽組織、根、塊莖等）浸泡在冰水中 10 分鐘，取出用紙吸干液體后浸泡在預(yù)冷的 40 mL 勻漿液（已加 0.1% BSA）中，在浸泡狀態(tài)下剪成 1 cm2 大小的碎片。注意：處理樣品量太大的話線粒體產(chǎn)率會(huì)急劇降低，所以如果同一樣品太多可分  成多組平行處理，得到線粒體粗提物后再匯集，

2.將勻漿液和其中的植物組織碎片轉(zhuǎn)移到 Waring 勻漿器中，中速勻漿 3 次，每次 15秒，每次之間間隔 10 秒以便讓碎片沉淀到刀片處。也可使用研磨法，具體操作是將勻漿液和其中的植物組織碎片轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的研缽中，研磨 3-4 分鐘。注意：植物組織勻漿后釋放的物質(zhì)會(huì)使勻漿液酸化，降低 pH，而線粒體對(duì) pH 變化非常敏感，因此建議勻漿后用 pH 試紙檢測(cè)勻漿液的 pH，如果低于 7.0，必須用自備的 5 M KOH 將 pH 調(diào)到 7.0 以上才進(jìn)入下一步。

3.用帶柄尼龍篩過(guò)濾勻漿液，穿透液可通過(guò)預(yù)冷的漏斗收集到預(yù)冷的 50 mL 的塑料離心管中。本試劑盒提供的一個(gè)帶柄尼龍篩可以洗干凈后反復(fù)使用。

4.在低速固定角度冷凍離心機(jī)上 4℃ 1000×g 離心勻漿液 5 分鐘，上清含線粒體，沉淀為未破碎的細(xì)胞、破碎細(xì)胞的碎片、細(xì)胞核和淀粉顆粒等。小心轉(zhuǎn)移上清到新的預(yù)  冷的 50 mL 塑料離心管中。

5.將上步的離心管在水平冷凍離心機(jī)上 4℃ 12,000×g 離心 20 分鐘，棄上清液，所得棕綠色沉淀即為純化的線粒體粗提物。如果沉淀底部還有白色的淀粉沉淀，屬于正  ?，F(xiàn)象。

6.在沉淀中加入 10 mL 預(yù)冷的洗滌液（已加 0.1% BSA，下同）中，用軟毛筆輕柔重懸線粒體沉淀(如果最底下有白色淀粉沉淀，需要避免重懸之)。不能劇烈震蕩，否則  線粒體容易破裂。本試劑盒提供的一只軟毛筆可以洗干凈后反復(fù)使用。

7.將線粒體重懸液轉(zhuǎn)移到新的 50 mL 離心管中，再加入 30 mL 預(yù)冷的洗滌液，4℃ 1000×g 離心 5 分鐘。線粒體將在上清中。

8.將上清轉(zhuǎn)移到新的預(yù)冷的 50 mL 離心管中，4℃ 12000×g 離心 20 分鐘，沉淀為線粒體。小心棄上清。到此步時(shí)，線粒體回收率一般在 15-30%。

9.在線粒體沉淀中加入 2 mL 預(yù)冷的洗滌液。用軟毛筆輕柔重懸，得到線粒體粗提液。如果有平行提取，可將最多 4 管線粒體沉淀重懸在 2 mL 洗滌液中。線粒體粗提液中線粒體的回收率一般在 45-75%。

10.在顯微鏡下檢測(cè)重懸液中線粒體的完整性。具體做法是先滴一滴（約 50 μL）線粒體粗提液到載玻片上，再滴入 50 μL 0.2%詹納斯染液綠 B 染色液，混勻后 20 分鐘，油鏡下觀察，藍(lán)綠色顆粒狀物即為線粒體。

11.所得線粒體粗提液含其他細(xì)胞器（如類囊體膜, 質(zhì)體, 過(guò)氧化物酶體， 乙醛酸循環(huán)體, 或細(xì)菌）污染，但可直接用于 PCR 級(jí)線粒體 DNA 和 RNA 的提取。如果需要長(zhǎng)期保存，則直接放-80℃保存。如此保存的線粒體 DNA 完整性在幾年內(nèi)都不會(huì)發(fā)生變化。

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