目錄:上海烜雅生物科技有限公司>>分子生物學試劑>>試劑盒>> SP6體外轉(zhuǎn)錄及加帽試劑盒
供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 5次 |
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貨號 | XY-D-1690 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 化工,生物產(chǎn)業(yè) |
主要用途 | 科研 | 英文名稱 | SP6 in vitro Transcription and Capping Kit |
保存條件 | -20℃ | 有效期 | 12個月 |
產(chǎn)品簡介:
本試劑盒是基于 SP6 RNA 聚合酶的帶帽 RNA 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒,它利用含有SP6 啟動子的模版 DNA,以 NTP 和m7G(5' )ppp(5' )G 為底物,從 SP6 啟動子 下游開始合成與模版 DNA 中一條鏈互補的 RNA,簡單快速獲得大量的 RNA 分子。同時這些 RNA 中有部分 RNA 的 5′ 端含有 m7G 帽結(jié)構(gòu)。
產(chǎn)品特點:
1.即開即用,用戶只需提供含 SP6 啟動子的 DNA 模板即可以進行體外轉(zhuǎn)錄實驗。
2.體外轉(zhuǎn)錄和加帽同管一步式進行,不需要先體外轉(zhuǎn)錄再加帽。
3.單溶液預(yù)配液,減少加樣次數(shù),避免了操作誤差,增加了可重復性。
4.模版 DNA 可以是線性化的質(zhì)粒DNA,也可以是 PCR 擴增產(chǎn)物。
5.可以合成的 RNA 的最佳長度在 20nt 到 2000 nt 之間。
6.產(chǎn)品配方經(jīng)過精心優(yōu)化,每?g DNA 模版可以合成 2-6 ?g RNA。
7.得到的加帽 RNA 比不加帽的 RNA 更穩(wěn)定,可以用于RNA 結(jié)構(gòu)研究、核酶生物化學、體外翻譯、RNA-蛋白質(zhì)相互作用、反義技術(shù)、SELEX 技術(shù)和 RNA 干擾(RNAi)等實驗。
8.SP6體外轉(zhuǎn)錄及加帽試劑盒足夠 5 次 20 ?L 的體外轉(zhuǎn)錄實驗。本產(chǎn)品只能用于科研。
產(chǎn)品參數(shù):
成份 規(guī)格 包裝
2×SP6 體外轉(zhuǎn)錄及加帽預(yù)配液50 μL0.5 mL 本色管
SP6 RNA 聚合酶-RI 混合液10 μL0.5 mL 紅蓋管
RNase-free 水1 mL1.5 mL 藍蓋管
使用手冊1 份無
保存和運輸
低溫運輸,-20℃保存, 有效期一年。
自備試劑
如果需要去除轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的 DNA 模板,則需要自備 RNase-free DNase、Tris 飽
和酚、氯仿、微量核酸沉淀劑、RNase-free 75%乙醇。(均可從本公司另購)
使用方法:
一、制備 DNA 模板
PCR 片段和質(zhì)粒 DNA 都可以用作體外轉(zhuǎn)錄的模板,但是必須注意以下幾點。一是必須使用線性化的 DNA。如果是質(zhì)粒 DNA,則必須先用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切成線狀。二是需要轉(zhuǎn)錄的 DNA 序列的上游必須有 SP6 啟動子。如果模板是PCR 產(chǎn)物,則可以在設(shè)計引物時將 SP6 啟動子序列(5’ATT TAG GTG ACA CTA TAG AGN G 3’)加上,轉(zhuǎn)錄其實是從 3 端G AGN G 中的第一個 G 開始。如果是將 DNA 片段克隆到載體上,則需要選擇有 SP6 啟動子的載體,并
且克隆位點必須位于 SP6 啟動子下游。三是需要轉(zhuǎn)錄的 DNA 序列的下游端最
好不要是 3’突出。如果是 3’突出(如選擇了Pst I 來線性化質(zhì)粒),則最好用 T4 DNA 聚合酶修平。四是必須保證 DNA 模板中沒有 RNase。由于提取質(zhì)粒DNA 的過程中一般要使用大量的 RNase A,因此質(zhì)粒 DNA 一般都有嚴重的RNase A 污染,所以在用作模板前,最好采取膠回收得方法回收質(zhì)粒 DNA。并且加入少量總 RNA 一起保溫,然后電泳檢測 RNA 是否被降解,以此判斷純化的 DNA 模板是否有殘留RNase A。
二、體外轉(zhuǎn)錄及加帽反應(yīng)
1.如果有 N 個樣品,強烈建議做一個陰性對照,故共設(shè)置 N+1 個反應(yīng),這樣一起并排電泳時容易判斷哪個條帶是模板 DNA,哪個條帶是擴增得到的 RNA。在 N+1 個 RNase-free 的塑料離心管中,在室溫下(不是在 4℃下)按次序加入下列成分(T7 轉(zhuǎn)錄預(yù)配液容易產(chǎn)生結(jié)晶沉淀,一定要握在手中直到結(jié)晶徹-底溶解并搖勻后方可使用):
注:此為 20 μL 反應(yīng)體系的用量,對其他反應(yīng)體系,各成分的用量可以按比例增減。如果需要標記 RNA 探針,則需要單獨訂購 NTP 分開的試劑盒。
2.37℃保溫 1-2 小時。注意:延長保溫時間并不能提高產(chǎn)量。
3.70℃加熱 10 分鐘滅活 SP6 RNA 聚合酶。
4.取 1-3μL 電泳檢測轉(zhuǎn)錄效果。此時除 DNA marker 外,最好再用 DNA 模板做電泳對照。電泳時比陰性對照多出的條帶就是擴增得到的 RNA(由于合成的RNA 長度不均勻,即使長度均勻,但由于自生形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),泳動速度也不一致,所以電泳所得 RNA 條帶一般都不是清晰,而是比較彌散的電泳條帶。但由于 RNA 是單鏈,分子量比同樣長度的 DNA 小一倍,因此轉(zhuǎn)錄得到的 RNA 一般比其雙鏈的 DNA 模板電泳速度更快
5.定量,可以用自備的單鏈 RNA 定量試劑盒檢測濃度,也可以肉眼比較電泳膠上 RNA 和 DNA 的強度。由于 RNA 是單鏈,跟核酸染料結(jié)合力低,因此同等亮度的 RNA 條帶,其 RNA 分子數(shù)一般比 DNA 的分子數(shù)多一倍。使用本試劑
盒時 1 μg DNA 模板一般可以合成 2-6 μg 的RNA(部分為 5 端帶帽的RNA)。
6. 得到的 RNA 可以放-80℃保存或立即使用。
注:若需進一步去除 DNA 模板,可參考下列操作步驟,但所用試劑需另行購買。
1.在體外轉(zhuǎn)錄體系中加入 3-5 U 自備的 RNase-free DNase(CAT#:90903; 3-5 U/μL)。
2.37℃保溫 15-30 分鐘降解 DNA。
3.補水到 100 μL(體積太小不方便下步的酚氯仿抽提)。
4.用等體積的 Tris 飽和酚-氯仿抽提一次去除殘留的DNase 和 RNA 聚合酶。
5.在上清中加 200 μL 自備的微量核酸沉淀劑(CAT#50903;用前需要搖晃混勻),振蕩后 15000 rpm 離心 3-5 分鐘,棄上清。
6.加入 1 mL 75%乙醇,震蕩 10 秒后 15000 rpm 離心 3-5 分鐘,棄上清。
7.短暫離心數(shù)秒,用槍頭吸棄上清。
8.晾干半分鐘,所得沉淀即去除 DNA 模板后的 RNA。可溶于 RNase-free 水中后立即使用或放-80℃長期保存。
選擇我們的SP6體外轉(zhuǎn)錄及加帽試劑盒,就是選擇精準、高效、可靠的檢測方案,為您的科研實驗保駕護航!