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產(chǎn)品簡介：

基因的定點突變是重要的分子生物學技術(shù)，廣泛用于載體構(gòu)建、基因改造、蛋白質(zhì)功能研究等領(lǐng)域。本產(chǎn)品就是專門用于從含有野生型DNA插入片段的質(zhì)粒DNA快速制備突變（包括點突變、插入突變和缺失突變）的試劑盒。

產(chǎn)品特點：

1.直接使用甲基化的質(zhì)粒DNA作為模板，故模板必須是從dam+基因型的大腸桿菌宿主菌中制備的，常見的dam+菌株是DH5?。某個菌株是不是 dam+需要詢問菌株供用廠家。

2.有管式操作，整個過程只需要2小時。

3.模板DNA的需求量很少，只需要2 ng。

4.模板長度為10-15 Kb的DNA（包括質(zhì)粒的長度）。由于起始模板DNA很少，得到的擴增產(chǎn)物幾乎都是突變DNA，故突變效率高達90%。

5.實時檢測PCR擴增，不需要電泳檢測，節(jié)約寶貴的樣本材料。

6.最終產(chǎn)物可以直接用于化學轉(zhuǎn)化或電轉(zhuǎn)化。

7.基于PCR擴增，對模板DNA序列沒特殊要求，可以用于突變?nèi)魏蜠NA位點。

8.使用超保真酶，PCR過程中不會引入突變。

9.不但可以制備點突變，還可以制備1-3個堿基的缺失突變和插入突變。

10.本產(chǎn)品足夠10 次點突變實驗。

11.一管式點突變試劑盒只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

成份 規(guī)格包裝

染料法 2×超保真PCR MasterMix100 ?L0.5 mL 本蓋管

DpnI 限制性內(nèi)切酶，10 U/?L20 ?L0.5 mL 紅蓋管

超純水 1 mL1.5 mL 藍蓋管

使用手冊 1 份無

運輸及保存

低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。

自備試劑

質(zhì)粒 DNA、突變引物、細菌轉(zhuǎn)化試劑。

使用方法：

一、引物設(shè)計

1.需根據(jù)突變位點周邊序列設(shè)計兩條錯位互補引物，引物的 Tm 應(yīng)該在 72℃左右，突變位點（可以是 1 個堿基，也可以是數(shù)個堿基）左右各有 14 個完-全互補的堿基對， 上引物和下引物的 3’端各多出 6 個堿基。下面為一個虛擬序列的兩條錯位互補引物，XXX 表示三個野生型堿基。NNN 表示希望突變后得到的堿基。陰影部分的序列

跟其互補鏈是完-全互補。

GCGATACGCAACTANNNGATCTCCATGCAGCTCATGC-3' 3'-TGCGACCGCTATGCGTTGATXXXCTAGAGGTACGTCG

2.引物的 GC 含量在 40％-60％之間，不能在 PCR 時形成引物二聚體。

3.引物必須 HPLC 純化。

4.本方法是以質(zhì)粒 DNA 為模板進行 PCR 擴增，因此質(zhì)粒 DNA 完整性非常重要。如果質(zhì)粒 DNA 有大量的 nick 或 gap（限制性內(nèi)切酶酶切雙鏈 DNA 不能發(fā)現(xiàn)某條單鏈 DNA 上是否有 nick 或 gap），則本方法的成功率將會降低。如果質(zhì)粒宿主菌 DNase 活性沒有去除干凈，從中純化的質(zhì)粒 DNA 將會有更多 nick。如果模板不是新鮮制備的質(zhì)粒 DNA，初步測試后效果不好，建議用自備的 E.coli DNA 連接酶對 nick 進行修復(fù)。操作請按E.coli DNA 連接酶使用手冊進行。

二、一管式點突變 PCR（20 ?L 體系）

5.按下表設(shè)置兩個 PCR 反應(yīng)：

成分樣本管陰性對照管模板 DNA2 ng-

染料法 2×超保真PCR MasterMix10 ?L10 ?L

自備引物一(10 ?M)1 ?L不加

自備引物二(10 ?M)不加1 ?L

補超純水到終體積20 ?L20 ?L

6.放入熒光定量PCR 儀中按下面參數(shù)進行PCR：

步驟溫度時間循環(huán)數(shù)

變性98℃3 分鐘1 次

PCR98℃20 秒30 次，在

68℃時采集 SYBR

通道的熒

光信號

68℃30 秒

72℃30 秒/Kb（質(zhì)

粒 DNA 長度）

注意：由于本產(chǎn)品是染料法實時 PCR，故盡管設(shè)置的循環(huán)次數(shù)是 30 次，但具體循環(huán)次數(shù)取決于擴增曲線。最佳循環(huán)數(shù)是樣本管的擴增信號剛好進入平臺區(qū)的循環(huán)次數(shù)，在進入平臺區(qū)后，可在復(fù)性步驟手動停止 PCR。

7.按熒光定量 PCR 儀廠家提供操作流程進行溶解曲線分析。樣本的 Tm 應(yīng)該比對照高

（長處更對照管如果有 Tm，也是引物二聚體的 Tm），如果兩者的 Tm 一樣，則可能是樣本擴增失敗，需要電泳檢測擴增產(chǎn)物的長度。

三、DpnI 酶消化和后續(xù)操作

8.在 PCR 反應(yīng)管中加入 1 ?L DpnI 限制性內(nèi)切酶，混勻后 37℃孵育 2 小時。

9.反應(yīng)液可以直接取 1-2 ?L 用于化學轉(zhuǎn)化和電轉(zhuǎn)化，或者放-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

10.轉(zhuǎn)化后通常會得到 50 個-500 個菌落，95%是所需要的突變。而對照沒有菌落。

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