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產(chǎn)品簡介：

易錯PCR（Error-Prone PCR）是利用天然 Taq DNA 聚合酶不具有 3′→5′校對功能的特性，在一定條件下（如不同的dNTP 濃度、不同 Mg2+濃度和有 MnCl2 存在）能夠按較高的機率隨機引入突變而設計。如果有適當?shù)耐蛔冞x擇方法，則可從構建的突變庫選出所需突變體，用于人工誘變。但是易錯 PCR 在操作中最大的問題是最佳PCR 循環(huán)數(shù)的摸索，循環(huán)次數(shù)太多或太少，都得不到成形的突變 DNA 條帶，影響后續(xù)的 DNA 回收和克隆步驟。

產(chǎn)品特點：

1.即開即用，十分簡單方便。

2.可以實時監(jiān)控 PCR 的進程，用戶可以不需要任何摸索就能在最佳時間（熒光信號剛進入平臺期）停止PCR，立即進行電泳，回收到突變 DNA。

3.配方經(jīng)過精心優(yōu)化，突變率穩(wěn)定，用本試劑盒進行一次標準的易錯 PCR 擴增實驗一般會得到 6-7 個突變（對 1000 bp 的片段而言）。進行定向突變時每個基因有 2-6 個突變?yōu)樽罴逊秶?/p>

4.比體內基因突變更快捷簡單，但如果在 PCR 引物中設計位點，則可使產(chǎn)物克隆到表達載體，也可以用于體內蛋白活性的篩選。

5.可用于連續(xù)易錯 PCR（sequential error-prone PCR），只需把上一次易錯 PCR 的產(chǎn)物用作下一次易錯 PCR 的模板即可，使每一次獲得的小突變累積而產(chǎn)生重要的有益突變。

6.只適用于擴增 1 kb 以下的產(chǎn)物，對于 1 kb 以上的產(chǎn)物，建議分段擴增。

7.本產(chǎn)品足夠 100 次 30 ?L 體系的染料法實時易錯PCR 反應。

8.染料法實時易錯 PCR 試劑盒只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

成份規(guī)格包裝

10×易錯PCR Mix（含酶）300 ?L0.5 mL 紅蓋管

染料法易錯 PCR 專用 dNTP300 ?L0.5 mL 黃蓋管

易錯PCR 增強劑300 ?L0.5 mL 白蓋管

追加dNTP，0.5 mM300 ?L0.5 mL 本色管

易錯PCR 專用 MnCl2300 ?L0.5 mL 綠蓋管

使用手冊1 份1 份

運輸及保存

低溫運輸，-20℃保存，有效期為一年。

自備試劑

引物、DNA 模板、超純水。

使用方法：

1.將自備的 PCR 引物稀釋到 10 ?M。引物是決定易錯 PCR 成敗的關鍵因素，設計引物時要保證其 Tm 在 70℃，長度在 25-30 nt 之間，GC 含量在 45%-60%之間，3端 GC 含量低，并且沒有發(fā)夾結構。

2.用自備引物和自備的常規(guī)PCR 試劑擴增制備易錯 DNA 模板（常規(guī) PCR 產(chǎn)物），膠回收并準確確定濃度。注意：易錯 PCR 的模板一定要用膠回收的常規(guī) PCR 產(chǎn)物， 因為膠回收可以把電泳不可見的非特異性擴增片段去除，否則這些片段由于也是用易錯 PCR 引物擴增所得，在易錯 PCR 擴增時也會被擴增，產(chǎn)生競爭抑制，降低靶分子的擴增效率。如果常規(guī)PCR 制備模板的引物和易錯PCR 引物不同（類似巢式PCR） 則可以避免此問題，但需要合成兩對引物。本試劑盒只適用于擴增 1 kb 以下的產(chǎn)物， 對于 1 kb 以上的產(chǎn)物，建議分段擴增。

3.將回收的 DNA 片段（模板）用水稀釋到 1 ng/?L 、10 ng/?L 和 100 ng/?L 三個濃度。注意：模板使用量是影響突變率的最重要因素，因為模板 DNA 為非突變 DNA， 擴增產(chǎn)生的 DNA 為突變 DNA，易錯 PCR 體系跟常規(guī) PCR 一樣，最后會達到擴增平臺，最終得到的擴增 DNA 的量是固定的，因此起始模板 DNA 使用量越大，則突變 DNA 在最終得到的總DNA 中的相對比例就越低。但模板太少又不容易擴增成功， 所以建議同時測試三個模板用量。如果都成功，則優(yōu)先選用模板濃度低的 PCR 產(chǎn)物進行分析。

4.設置 30 μL 體系的易錯 PCR 反應。在干凈的 PCR 管中，分別加入下列成分。由于

Mn 離子容易跟其他成分發(fā)生沉淀反應，因此上機前最后加 MnCl2：

成分管 1管 2管 3

10×易錯PCR Mix（含酶）3 ?L3 ?L3 ?L

自備 DNA 模板1 ?L

（1 ng/ ?L）1 ?L

（10 ng/ ?L）1 ?L

（100 ng/ ?L）

自備易錯PCR 引物

(10 ?M each)各 1 ?L各 1 ?L各 1 ?L

易錯PCR 增強劑3 ?L3 ?L3 ?L

染料法易錯PCR 專用dNTP3 ?L3 ?L3 ?L

易錯PCR 專用 MnCl23 ?L3 ?L3 ?L

補自備超純水加到 30 ?L加到 30 ?L加到 30 ?L

5.立即按下列參數(shù)進行易錯PCR：

步驟參數(shù)循環(huán)數(shù)

PCR 前變性94℃ 3 min循環(huán) 1 次

染料法實時易錯PCR94℃ 1 min

循環(huán) 60 次，在 72℃ 時采集 SYBR Green I 通道的熒光信號

60℃ 1 min

72℃ 3-10 min

注：由于易錯 PCR 含高濃度的鎂離子，因此引物容易互為模板形成引物二聚體，因此使用 60℃為復性溫度。在錯誤堿基摻入后，DNA 合成會暫時停滯，因此為了讓DNA 合成繼續(xù)，需要延長合成的時間到 3-10 分鐘。易錯 PCR 循環(huán)次數(shù)越多，突變DNA（擴增產(chǎn)物）與非突變 DNA（原始模板）的比例就越高。此外在突變率和模板長度恒定的情況下，擴增次數(shù)越多，發(fā)生突變的絕對數(shù)就越高，在同一模板上發(fā)生的突變位點數(shù)就越多。但循環(huán)次數(shù)過多，又得不到完成的 DNA 條帶，沒法進行后續(xù)的克隆。所以可以設置 60 次循環(huán)并不表示要完成 60 次，而是需要在熒光信號不再增長，進入平臺期后立即停止易錯 PCR 并進行電泳回收。

6.易錯 PCR 結束后，立即電泳檢測。如果擴增產(chǎn)物長度正確，則進行膠回收，再進行克隆和測序等后續(xù)操作。如果需要增加突變率，可以選擇一個突變后的 DNA 為模板， 再進行下一輪易錯PCR。

7.如果沒有擴增，則按下列操作進行追加 PCR。

8.在易錯 PCR 管中，加入 3 ?L 追加dNTP 到 27 ?L 剩下的染料法實時易錯 PCR 體系中，按下表進行追加實時PCR（chasing Real-Time PCR）。

9.追加實時PCR 熒光信號進入平臺期后立即結束PCR，并不需要等到 20 個循環(huán)結束，并進行電泳檢測。如果有 DNA 條帶并且長度正確，則再進行克隆和測序等后續(xù)操作。如果需要增加突變率，可以選擇一個突變后的 DNA 為模板，再進行下一輪易錯 PCR。

10.如果沒有預期大小的 PCR 產(chǎn)物，則需要分析原因。

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