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產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

易錯(cuò)PCR（Error-Prone PCR）是利用天然 Taq DNA 聚合酶不具有 3′→5′校對(duì)功能的特性，在一定條件下（如不同的dNTP 濃度、不同 Mg2+濃度和有 MnCl2 存在）能夠按較高的機(jī)率隨機(jī)引入突變而設(shè)計(jì)。如果有適當(dāng)?shù)耐蛔冞x擇方法，則可從構(gòu)建的突變庫選出所需突變體，用于人工誘變。但是易錯(cuò) PCR 在操作中最大的問題是最佳PCR 循環(huán)數(shù)的摸索，循環(huán)次數(shù)太多或太少，都得不到成形的突變 DNA 條帶，影響后續(xù)的 DNA 回收和克隆步驟。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.即開即用，十分簡(jiǎn)單方便。

2.可以實(shí)時(shí)監(jiān)控 PCR 的進(jìn)程，用戶可以不需要任何摸索就能在最佳時(shí)間（熒光信號(hào)剛進(jìn)入平臺(tái)期）停止PCR，立即進(jìn)行電泳，回收到突變 DNA。

3.配方經(jīng)過精心優(yōu)化，突變率穩(wěn)定，用本試劑盒進(jìn)行一次標(biāo)準(zhǔn)的易錯(cuò) PCR 擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)一般會(huì)得到 6-7 個(gè)突變（對(duì) 1000 bp 的片段而言）。進(jìn)行定向突變時(shí)每個(gè)基因有 2-6 個(gè)突變?yōu)樽罴逊秶?/p>

4.比體內(nèi)基因突變更快捷簡(jiǎn)單，但如果在 PCR 引物中設(shè)計(jì)位點(diǎn)，則可使產(chǎn)物克隆到表達(dá)載體，也可以用于體內(nèi)蛋白活性的篩選。

5.可用于連續(xù)易錯(cuò) PCR（sequential error-prone PCR），只需把上一次易錯(cuò) PCR 的產(chǎn)物用作下一次易錯(cuò) PCR 的模板即可，使每一次獲得的小突變累積而產(chǎn)生重要的有益突變。

6.只適用于擴(kuò)增 1 kb 以下的產(chǎn)物，對(duì)于 1 kb 以上的產(chǎn)物，建議分段擴(kuò)增。

7.本產(chǎn)品足夠 100 次 30 ?L 體系的染料法實(shí)時(shí)易錯(cuò)PCR 反應(yīng)。

8.染料法實(shí)時(shí)易錯(cuò) PCR 試劑盒只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

成份規(guī)格包裝

10×易錯(cuò)PCR Mix（含酶）300 ?L0.5 mL 紅蓋管

染料法易錯(cuò) PCR 專用 dNTP300 ?L0.5 mL 黃蓋管

易錯(cuò)PCR 增強(qiáng)劑300 ?L0.5 mL 白蓋管

追加dNTP，0.5 mM300 ?L0.5 mL 本色管

易錯(cuò)PCR 專用 MnCl2300 ?L0.5 mL 綠蓋管

使用手冊(cè)1 份1 份

運(yùn)輸及保存

低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期為一年。

自備試劑

引物、DNA 模板、超純水。

使用方法：

1.將自備的 PCR 引物稀釋到 10 ?M。引物是決定易錯(cuò) PCR 成敗的關(guān)鍵因素，設(shè)計(jì)引物時(shí)要保證其 Tm 在 70℃，長度在 25-30 nt 之間，GC 含量在 45%-60%之間，3端 GC 含量低，并且沒有發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

2.用自備引物和自備的常規(guī)PCR 試劑擴(kuò)增制備易錯(cuò) DNA 模板（常規(guī) PCR 產(chǎn)物），膠回收并準(zhǔn)確確定濃度。注意：易錯(cuò) PCR 的模板一定要用膠回收的常規(guī) PCR 產(chǎn)物， 因?yàn)槟z回收可以把電泳不可見的非特異性擴(kuò)增片段去除，否則這些片段由于也是用易錯(cuò) PCR 引物擴(kuò)增所得，在易錯(cuò) PCR 擴(kuò)增時(shí)也會(huì)被擴(kuò)增，產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)抑制，降低靶分子的擴(kuò)增效率。如果常規(guī)PCR 制備模板的引物和易錯(cuò)PCR 引物不同（類似巢式PCR） 則可以避免此問題，但需要合成兩對(duì)引物。本試劑盒只適用于擴(kuò)增 1 kb 以下的產(chǎn)物， 對(duì)于 1 kb 以上的產(chǎn)物，建議分段擴(kuò)增。

3.將回收的 DNA 片段（模板）用水稀釋到 1 ng/?L 、10 ng/?L 和 100 ng/?L 三個(gè)濃度。注意：模板使用量是影響突變率的最重要因素，因?yàn)槟０?DNA 為非突變 DNA， 擴(kuò)增產(chǎn)生的 DNA 為突變 DNA，易錯(cuò) PCR 體系跟常規(guī) PCR 一樣，最后會(huì)達(dá)到擴(kuò)增平臺(tái)，最終得到的擴(kuò)增 DNA 的量是固定的，因此起始模板 DNA 使用量越大，則突變 DNA 在最終得到的總DNA 中的相對(duì)比例就越低。但模板太少又不容易擴(kuò)增成功， 所以建議同時(shí)測(cè)試三個(gè)模板用量。如果都成功，則優(yōu)先選用模板濃度低的 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行分析。

4.設(shè)置 30 μL 體系的易錯(cuò) PCR 反應(yīng)。在干凈的 PCR 管中，分別加入下列成分。由于

Mn 離子容易跟其他成分發(fā)生沉淀反應(yīng)，因此上機(jī)前最后加 MnCl2：

成分管 1管 2管 3

10×易錯(cuò)PCR Mix（含酶）3 ?L3 ?L3 ?L

自備 DNA 模板1 ?L

（1 ng/ ?L）1 ?L

（10 ng/ ?L）1 ?L

（100 ng/ ?L）

自備易錯(cuò)PCR 引物

(10 ?M each)各 1 ?L各 1 ?L各 1 ?L

易錯(cuò)PCR 增強(qiáng)劑3 ?L3 ?L3 ?L

染料法易錯(cuò)PCR 專用dNTP3 ?L3 ?L3 ?L

易錯(cuò)PCR 專用 MnCl23 ?L3 ?L3 ?L

補(bǔ)自備超純水加到 30 ?L加到 30 ?L加到 30 ?L

5.立即按下列參數(shù)進(jìn)行易錯(cuò)PCR：

步驟參數(shù)循環(huán)數(shù)

PCR 前變性94℃ 3 min循環(huán) 1 次

染料法實(shí)時(shí)易錯(cuò)PCR94℃ 1 min

循環(huán) 60 次，在 72℃ 時(shí)采集 SYBR Green I 通道的熒光信號(hào)

60℃ 1 min

72℃ 3-10 min

注：由于易錯(cuò) PCR 含高濃度的鎂離子，因此引物容易互為模板形成引物二聚體，因此使用 60℃為復(fù)性溫度。在錯(cuò)誤堿基摻入后，DNA 合成會(huì)暫時(shí)停滯，因此為了讓DNA 合成繼續(xù)，需要延長合成的時(shí)間到 3-10 分鐘。易錯(cuò) PCR 循環(huán)次數(shù)越多，突變DNA（擴(kuò)增產(chǎn)物）與非突變 DNA（原始模板）的比例就越高。此外在突變率和模板長度恒定的情況下，擴(kuò)增次數(shù)越多，發(fā)生突變的絕對(duì)數(shù)就越高，在同一模板上發(fā)生的突變位點(diǎn)數(shù)就越多。但循環(huán)次數(shù)過多，又得不到完成的 DNA 條帶，沒法進(jìn)行后續(xù)的克隆。所以可以設(shè)置 60 次循環(huán)并不表示要完成 60 次，而是需要在熒光信號(hào)不再增長，進(jìn)入平臺(tái)期后立即停止易錯(cuò) PCR 并進(jìn)行電泳回收。

6.易錯(cuò) PCR 結(jié)束后，立即電泳檢測(cè)。如果擴(kuò)增產(chǎn)物長度正確，則進(jìn)行膠回收，再進(jìn)行克隆和測(cè)序等后續(xù)操作。如果需要增加突變率，可以選擇一個(gè)突變后的 DNA 為模板， 再進(jìn)行下一輪易錯(cuò)PCR。

7.如果沒有擴(kuò)增，則按下列操作進(jìn)行追加 PCR。

8.在易錯(cuò) PCR 管中，加入 3 ?L 追加dNTP 到 27 ?L 剩下的染料法實(shí)時(shí)易錯(cuò) PCR 體系中，按下表進(jìn)行追加實(shí)時(shí)PCR（chasing Real-Time PCR）。

9.追加實(shí)時(shí)PCR 熒光信號(hào)進(jìn)入平臺(tái)期后立即結(jié)束PCR，并不需要等到 20 個(gè)循環(huán)結(jié)束，并進(jìn)行電泳檢測(cè)。如果有 DNA 條帶并且長度正確，則再進(jìn)行克隆和測(cè)序等后續(xù)操作。如果需要增加突變率，可以選擇一個(gè)突變后的 DNA 為模板，再進(jìn)行下一輪易錯(cuò) PCR。

10.如果沒有預(yù)期大小的 PCR 產(chǎn)物，則需要分析原因。

選擇我們的染料法實(shí)時(shí)易錯(cuò) PCR 試劑盒，就是選擇精準(zhǔn)、高效、可靠的檢測(cè)方案，為您的科研實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航！