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產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

端粒酶存在于 85-90%的腫瘤組織中，因此通過(guò)檢測(cè)端粒酶活性就有可能早期診斷大多數(shù)腫瘤。目前最-常用的檢測(cè)端粒酶活性的方法就是 TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol，端粒重復(fù)片段擴(kuò)增)，它利用端粒酶能在底物 DNA 末端添加不同數(shù)量的TTAGGG 序列這一特點(diǎn)，通過(guò)PCR 檢測(cè)延伸產(chǎn)物而高效檢測(cè)端粒酶活性。但是傳統(tǒng)的 TRAP 方法為終點(diǎn)電泳檢測(cè)法，靈敏度低，沒(méi)法定量，同時(shí)還容易產(chǎn)生氣溶膠污染。為克服這些缺點(diǎn)，本公司開(kāi)發(fā)了基于探針?lè)?qPCR 的 TRAP 試劑盒。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.即開(kāi)即用，提供從細(xì)胞裂解到 qPCR 所有試劑，免去自己優(yōu)化條件。

2.基于探針?lè)晒舛?PCR，比電泳法 TRAP 靈敏度高。

3.使用探針，專一性比電泳法 TRAP 高。

4.提供陽(yáng)性對(duì)照，可以進(jìn)行基于此對(duì)照的定量分析。

5.一管式操作，免去氣溶膠污染之憂。

6.既可用于定量，又可用于定性。用于定量時(shí)線性范圍至少有 5 個(gè)數(shù)量級(jí)。

7.既可用于培養(yǎng)細(xì)胞，也可用于實(shí)體組織（包括腫瘤組織）。

8.本產(chǎn)品足夠 50 次 20 μL 體系的 TRAP PCR 檢測(cè)。

9.小鼠端粒酶活性檢測(cè)試劑盒（探針?lè)═RAP）只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

編號(hào)規(guī)格包裝

TRAP 專用細(xì)胞裂解液10 mL10 mL 本色瓶

2×TRAP 專用 qPCR

MasterMix0.5 mL0.5 mL 本色蓋

熒光PCR 模板專用稀釋液1.0 mL1.5 mL 綠色蓋

小鼠TRAP 檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照

（1E7 拷貝/μL）50 μL0.5 mL 黃色蓋

小鼠端粒酶底物干粉50 次0.5 mL 白色蓋

小鼠TRAP 引物-探針干粉50 次1.5 mL 棕色管

超純水1 mL1.5 mL 藍(lán)色蓋

使用手冊(cè)1 份1 份

運(yùn)輸及保存

低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期 24 個(gè)月。

自備試劑

BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒，固相 RNase 清除劑。

使用方法：

一：標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的制備

以陽(yáng)性對(duì)照 1E1-1E6 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。

1.標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 6、5、4、3、2、1。

2.在 1-6 號(hào)管中加入 45 μL 熒光PCR 專用模板稀釋液。

3.在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1E7 拷貝/μL 的小鼠TRAP 檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩

1 分鐘，得 1E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在 4 號(hào)管中加入 5 μL 1E5 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩

1 分鐘，得 1E4 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線陽(yáng)性樣品。放冰上待用。二：端粒酶的提取

注意：端粒酶的組成成分中有 RNA，極容易被降解，因此，提取端粒酶應(yīng)該跟提取

RNA 一樣，盡量在低溫條件下快速操作、最好使用本公司的固相 RNase 清除劑預(yù)先清潔試驗(yàn)臺(tái)面等容易有 RNase 污染的地方。

7.對(duì)冷凍的實(shí)體組織：將 50-100 mg 在-80℃冷凍的組織放裝有液氮的研缽中研磨成粉末，再轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的玻璃勻漿器中，加入 200 μL 預(yù)冷的TRAP 專用細(xì)胞裂解液，溫和手動(dòng)勻漿 6 次后冰浴 30 分鐘，每間隔 5 分鐘渦旋振蕩一次，然后直接進(jìn)入第 10 步操作。

注意：為保證裂解效果，可在顯微鏡下觀察確保大部分細(xì)胞已經(jīng)裂解。如果組織樣品不足 50-100 mg，可以按比例降低TRAP 專用細(xì)胞裂解液用量。在-20℃保存的實(shí)體組織放置 2 個(gè)月后就失去端粒酶活性，而在-80℃保存的實(shí)體組織放置數(shù)年還有端粒酶活性。

8.對(duì)新鮮的培養(yǎng)細(xì)胞和組織：用自備的預(yù)冷 PBS 洗滌 1E6 個(gè)經(jīng)過(guò)胰-酶處理的細(xì)胞或50-100 mg 經(jīng)過(guò)胰-酶處理的新鮮組織，3000 g 4℃離心 5 分鐘，棄上清，細(xì)胞沉淀可以直接使用，也可以放-80℃保存后續(xù)使用。在細(xì)胞或組織沉淀中加入 200 μL 預(yù)冷的TRAP 專用細(xì)胞裂解液，輕柔吹打 3 次懸浮細(xì)胞或組織。對(duì)新鮮細(xì)胞：渦旋振蕩10 秒后置冰浴 30 分鐘，每間隔 5 分鐘渦旋振蕩一次。對(duì)新鮮組織：在冰上用玻璃勻漿器輕柔勻漿后冰浴 30 分鐘，每間隔 5 分鐘渦旋振蕩一次。如果細(xì)胞不足 1E6 或50-100 mg，按比例降低 TRAP 專用細(xì)胞裂解液用量。

9.14000 g 4℃離心 20 分鐘，收集 160 μL 上清（含端粒酶），留 40 μL 不取。

10.取部分上清液用自備 BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。

11.測(cè)出各樣品的蛋白濃度后，用 TRAP 專用細(xì)胞裂解液將各樣品的蛋白濃度調(diào)成 3 μg/μL，然后分裝合適的量到離心管中，將實(shí)驗(yàn)所需的數(shù)量放冰上待用，其余的放- 80℃長(zhǎng)期保存（可存放一年）。此步所得樣本稱為端粒酶待測(cè)樣本。

12.對(duì)每個(gè)樣本，一次實(shí)驗(yàn)需要兩管，一管用于測(cè)定端粒酶活性，一管用作該待測(cè)樣本的熱滅活陰性對(duì)照。制備方式是每個(gè)樣本取一管端粒酶待測(cè)樣本，95℃處理 10 分鐘滅活端粒酶，放冰上待用。沒(méi)有用完的可放-80℃長(zhǎng)期保存（可存放一年）供下次使用。

二：探針?lè)═RAP（20 μL 體系）

13.確定端粒酶待測(cè)樣本的：為便于比較，每個(gè)反應(yīng)所用的蛋白量總量（或?qū)?yīng)的細(xì)胞數(shù)）必須一樣，否則不好進(jìn)行樣本間的比較。

14.設(shè)置反應(yīng)。如果有N 個(gè)樣品，每個(gè)樣品做 1 次重復(fù)（一般建議作三個(gè)重復(fù)，此處為表述方便，假設(shè)只做 1 次重復(fù)），則需要準(zhǔn)備 2N+6 個(gè)反應(yīng)管。多 1 倍是因?yàn)槊總€(gè)樣本都需要一個(gè)對(duì)應(yīng)的熱滅活陰性對(duì)照。另外 1 個(gè)用作探針?lè)═RAP 陰性對(duì)照，最后 5 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本。按下表設(shè)置 20 μL 體系的探針?lè)═RAP：

15.吹打混勻后上機(jī)進(jìn)行端粒延伸和 PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)參數(shù)如下：

過(guò)程溫度時(shí)間

端粒延伸30℃30 min

預(yù)變性95℃5 min

PCR 反應(yīng)95℃15 sec

（45 個(gè)循環(huán)）57.5℃15 sec

72℃30 sec（采集 FAM 通道，淬滅基團(tuán)

為 MGB）

注：若使用 ABI 7500 qPCR 儀，復(fù)性溫度 57.5℃需改為 48℃。

三：結(jié)果分析

16.實(shí)驗(yàn)的有效性判斷：如果標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本管的FAM 信號(hào)結(jié)果為陰性（無(wú) Ct 值，或者大于或等于 35），則整個(gè)實(shí)驗(yàn)無(wú)效

不需要分析數(shù)據(jù)，需要重復(fù)實(shí)驗(yàn)或跟廠家聯(lián)系。如果探針?lè)?TRAP 陰性對(duì)照管的 FAM 信號(hào)結(jié)果均為陽(yáng)性（有 Ct 值小于 35），說(shuō)明環(huán)境污染，則整個(gè)實(shí)驗(yàn)無(wú)效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要跟廠家聯(lián)系。如果標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本管的 FAM 信號(hào)結(jié)果為陽(yáng)性，探針?lè)?TRAP 陰性對(duì)照管的結(jié)果為陰性，則實(shí)驗(yàn)有效，可以進(jìn)入下步分析。

17.標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：以5 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本濃度的log 值為橫軸，以陽(yáng)性對(duì)照（FAM 通道） 的 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，陽(yáng)性對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)曲線為斜線，r2 必須大于 0.95。再以待測(cè)端粒樣品的 Ct 值從陽(yáng)性對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出待測(cè)端粒酶所合成的端粒重復(fù)序列的拷貝數(shù)的 log 值，再有此 log 值推算出新合成的端粒重復(fù)序列拷貝數(shù)。由于新合成的端粒 DNA 重復(fù)序列的拷貝數(shù)跟端粒酶的活性相關(guān)。因此端粒酶活性大小跟測(cè)試的 Ct 呈現(xiàn)反相關(guān)，同一次實(shí)驗(yàn)所得的 Ct 值可以用來(lái)比較各所測(cè)各樣本中端?；钚缘南鄬?duì)大小。

選擇我們的小鼠端粒酶活性檢測(cè)試劑盒（探針?lè)═RAP），就是選擇精準(zhǔn)、高效、可靠的檢測(cè)方案，為您的科研實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航！