Universal miRNA Mini Kit

通用型 microRNA 快速提取試劑盒

通用型microRNA快速提取試劑盒

目錄號：91015

產(chǎn)品內(nèi)容

自備試劑

無水乙醇

保存條件

室溫（15 ~ 25℃）

產(chǎn)品簡介

裂解液 RL 是 RNAzol (Trizol )，配合 miRNA 專用的溶液體系，專用于快速提取各種細(xì)胞、動(dòng)物、植物、真菌、昆蟲、細(xì)菌、微生物等樣品的 miRNA和其它各種小 RNA(15-30 nt)。

可以提出來包含 micoRNA 的總 RNA，用于 microRNA 的 RT、qPCR檢測，以及全轉(zhuǎn)錄組測序等；根據(jù)需要，也可以一次性把 microRNA 和總 RNA（mRNA、tRNA、rRNA）分別提出來。

但是市場上常見的離心柱型的 RNA Kit/總 RNA Kit 不能有效吸附回收miRNA，Trizol 沉淀抽提法也不能有效沉淀回收 miRNA（生物通上有專題文章闡述）。

產(chǎn)品特點(diǎn)

1. 本公司生產(chǎn)的 Universal miRNA Kit 質(zhì)量優(yōu)異，可以wan美替代 Qiagen 的miRNeasy Mini kit。

2. 可在常溫下提取 RNA，不需要 4℃離心機(jī)；亦可以兼容 4℃離心機(jī)。

注意事項(xiàng)

1. 采集 RNA 樣本時(shí)，把新鮮組織樣本浸入 RNAsafe (RNA 樣品保存液，Cat#91115-100)中，可在 37℃保存一天，可在 25℃保存一周，可在 4℃ 保存一個(gè)月，在-20℃或者–80℃長期保存。

2. 樣品應(yīng)避免反復(fù)凍融，否則會(huì)影響 RNA 的提取得率和質(zhì)量。

3. 樣品加入裂解液 RL（RNAzol）勻漿后，加lv仿前，樣品可在–80℃保存一個(gè)月以上；提取過程中應(yīng)使用不含 RNase 的吸頭和器皿。

重要提示：

① 第一次使用前, 先在 Wash Solution 1、Wash Solution 2/3 中加入zhi定量無水乙醇，詳見瓶上的標(biāo)簽。

② 所有離心步驟均需要在室溫（15~37℃）下進(jìn)行，提取效果更佳！

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

操作步驟（可得到包含 miRNA 的總 RNA）

1. 材料處理：

a．組織（動(dòng)物、植物、真菌）：將組織在液氮中磨成細(xì)粉。取適量細(xì)粉加入 1 ml 裂解液 RL，劇烈渦旋震蕩，充分混勻。

樣品投入量：動(dòng)物組織為 30~50 mg；植物/真菌為：50~100 mg。

b．單層貼壁培養(yǎng)細(xì)胞：吸去培養(yǎng)液，直接在培養(yǎng)皿/瓶中加入適量裂解液RL，每 10cm2 加 1ml 裂解液 RL，用移液器反復(fù)抽打幾次，幫助裂解。

c． 懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，吸棄上清，每 5×106個(gè)細(xì)胞加 1ml 裂解液RL。加裂解液 RL 前不要洗滌細(xì)胞，以免降解 RNA。

d．血液：取新鮮血液，加入 3 倍體積裂解液 RL，充分振蕩混勻。（推薦0.25 ml 血液+0.75 ml 裂解液 RL）

2. 將裂解物在室溫下放置 5 min，使得核酸蛋白復(fù)合物wan全分離。

3. 加入 200μl 氯仿，劇烈振蕩 15 秒，并在室溫下放置 2 分鐘，

4. 13,000 rpm 離心 10 分鐘。

5. 吸取 500 μl 上清轉(zhuǎn)入新的 2.0 ml 離心管中，加入 1.5 倍體積（750 μl）的無水乙醇，吹打混勻。

6. 每次轉(zhuǎn)移≤750 μl上清混合液至RNA吸附柱中，12,000 rpm離心1 min，倒棄濾液。此時(shí) RNA 被吸附在膜上，重復(fù)此過程，直到所有溶液都上柱。

7. 向 RNA 吸附柱內(nèi)加入 700 μl Wash Solution 1（檢查是否已加入乙醇），12,000 rpm 離心 1 min，倒棄濾液。

8. 向 RNA 吸附柱內(nèi)加入 500 μl Wash Solution 2/3（是否已加入乙醇），12,000 rpm 離心 1 min，倒棄濾液。

9. 重復(fù)步驟 8 一次。

10. 將 RNA 吸附柱放回空收集管中，12,000 rpm 離心 2 min，除去乙醇。

11. 取出 RNA 吸附柱，放入新的 RNase-Free 1.5 ml 離心管中，向吸附膜的中央部位懸空滴加50~100μl RNase-Free ddH2O，室溫放置1min，12,000rpm離心1min，管底即：包含microRNA的總RNA。

12. 得到的 RNA，可直接用于下游實(shí)驗(yàn)，或于-70℃保存，避免 RNA 降解。

附：microRNA 富集方法（僅僅提取 microRNA，不包含>200 nt 其它總RNA 成份。一般不推薦）

注意：當(dāng)非特異擴(kuò)增較多或者擴(kuò)增背景較高時(shí)，可以嘗試使用富集方法提取的microRNA。

1. 按照前面標(biāo)準(zhǔn)操作步驟 1 ~ 4 操作，直到得到上清。

2. 吸取 500 μl 上清至新的 2.0 ml 離心管，加入等體積 70％乙醇（必須是室溫的），吹打混勻。

3. 吸取 700 μl 上清混合液，加入一個(gè) RNA 吸附柱中，12,000 rpm 離心 1min，收集濾液。并將濾液轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的離心管，然后把 RNA 吸附柱放回空的收集管內(nèi)，再加入剩下的混合物，離心，收集濾液。

此時(shí)，濾液含有 microRNA, RNA 吸附柱的膜上是去除了 microRNA 的總RNA（mRNA、tRNA、rRNA），如果有需要，可以按照前面標(biāo)準(zhǔn)操作步驟7－11 操作，漂洗、洗脫，得到去除了 microRNA 的總 RNA。

4. 較精確估計(jì)濾液體積，加入 0.65 倍體積無水乙醇（必須是室溫的），吹打混勻，不要離心。

5. 將≤750 μl 濾液混合物加入 microRNA 吸附柱中， 12,000 rpm 離心 1min，micoRNA 被吸附在膜上，倒棄廢液。重復(fù)此過程，直到所有濾液混合物都上柱。

6. 按照前面標(biāo)準(zhǔn)操作步驟 7－11 操作漂洗，洗脫得到富集的 microRNA。

相關(guān)產(chǎn)品：

71418-25 Script III miRNA 1st Stand Synthesis Kit（加尾法）

71419-500 Script III miRNA Real-Time PCR Assay kit（for qPCR，加尾法）

71613-500 Script III miRNA RT-qPCR Detection kit（P418-25 + P419-500）

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