細(xì)胞色素b5（Cytochrome b5）含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

分光光度法 50 管/48 樣

細(xì)胞色素b5含量測(cè)定試劑盒

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

胞色素P450 酶是一組主要存在于肝臟的同工酶，在外源物質(zhì)代謝中具有重要作用，尤其是藥物和毒物的代謝。細(xì)胞色素 P450 和細(xì)胞色素b5 是P450 酶系的兩個(gè)血紅素蛋白，其比值的變化與 P450 代謝活性密切相關(guān)。

測(cè)定原理：

氧化型細(xì)胞色素 b5 經(jīng)連二亞硫suan鈉還原后，在 424nm 處有最大吸收峰，通過(guò)測(cè)定 424nm 和 490nm 處吸光值的差異，即可計(jì)算出細(xì)胞色素b5 的含量。

組成：

試劑一：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加 100ml 蒸餾水，充分溶解。

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、普通離心機(jī)，超速離心機(jī)、可調(diào)式移液槍、1ml 玻璃比色皿和蒸餾水。

工作液配制：

臨用前配制，戴一次性手套，小心打開(kāi)試劑三瓶蓋，加試劑二 50 ml 充分溶解，4℃避光可保存 1 周。

樣品中細(xì)胞色素 b5 提取：

1、除去細(xì)胞核，線(xiàn)粒體等大分子物質(zhì)：稱(chēng)約 0.5g 組織，加入 1ml 試劑一，冰上充分研磨，10 000g 4℃離心 30min，取上清液，轉(zhuǎn)入超速離心管中。

2、粗制微粒體：100 000g，4℃離心 60min，棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟 2 的沉淀中加 1ml 試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g 離心 30min，棄上清液。

4、待測(cè)液：向步驟 3 的沉淀中加試劑二 0.5ml，蓋緊后充分震蕩溶解，即待測(cè)液，該待測(cè)液需當(dāng)天測(cè)定。

細(xì)胞色素 b5 含量測(cè)定操作：

分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min。

工作液置于 25℃水浴中預(yù)熱 30 min。

空白管：取 1ml 玻璃比色皿，加入 50 μl 蒸餾水，1000μl 工作液，室溫靜置 2 min，424nm 和 490nm 處吸光值，424nm 處吸光值記為A 空白管 1，490nm 處吸光值記為A 空白管 2。△A 空白管= A 空白管 1- A

空白管 2

測(cè)定管：取 1ml 玻璃比色皿，加入 50 μl 待測(cè)液，1000μl 工作液，室溫靜置 2 min，424nm 和 490nm 處吸光值，424nm 處吸光值記為A 測(cè)定管 1，490nm 處吸光值記為A 測(cè)定管 2?！鰽 測(cè)定管= A 測(cè)定管 1- A

測(cè)定管 2。

注意：只需要做一個(gè)空白管。

樣品細(xì)胞色素 b5 含量計(jì)算公式：

按照蛋白濃度計(jì)算:

細(xì)胞色素b5 含量(nmol/mg prot)= (△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反總÷（Cpr×V 樣）

= 123×(△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷Cpr

按照樣本質(zhì)量計(jì)算:

細(xì)胞色素b5 含量（nmol/g 鮮重）= (△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反總×（V 樣總÷V 樣）÷W

= 61.4×(△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷W

ε：還原型細(xì)胞色素b5 納摩爾消光系數(shù)，171×10^-6 L/nmol/cm；d：比色皿光徑（cm），1cm； V 反總：反應(yīng)體系總體積，1.05 m L=0.00105 L；Cpr：待測(cè)液蛋白質(zhì)濃度（mg/ml），需要另外測(cè)定；V 樣：加入反應(yīng)體系中待測(cè)液體積，50 μl=0.05 ml；V 樣總：待測(cè)液總體積，0.5 ml；W：樣品質(zhì)量，g。

細(xì)胞色素b5含量測(cè)定試劑盒